老年原發性肝癌病人血清微小RNA-200a、微小RNA-221表達與介入術后感染的相關性分析

楊明，魏琦，易琨，張征，左偉

原發性肝癌為我國常見惡性腫瘤，起病隱匿，進展迅速，多數病人就診時已為中晚期，錯失最佳手術時機，經肝動脈栓塞化療（transarterial chemoembolization，TACE）介入術為現階段無法進行手術治療肝癌病人首選治療方法［1-4］。據調查顯示，與TACE介入術相關短暫細菌感染發生率高達4%，肝膿腫發生率約1.4%，而TACE介入術后肝膿腫形成未及時采取適當治療，病死率為13.4%～50.0%［5］。因此，探討原發性肝癌病人介入術后感染相關危險因素，尋找介入術后感染診斷標志物尤為重要。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類具有多重生物學效應的內源性非編碼單鏈小分子RNA逐漸出現在研究者視野［6-7］。研究發現，miR-200a、miR-221在肝癌病人血液中處于異常表達狀態，通過上調或下調其表達可抑制肝癌發生發展，推測二者極大可能參與了肝癌發生［8-9］，但關于其與老年原發性肝癌病人介入術后感染的相關性研究較為鮮見。本研究選取45例老年原發性肝癌介入術后感染病人作為研究對象，并設置病例對照，以探索老年原發性肝癌病人血清miR-200a、miR-221表達與介入術后感染的相關性，旨在為臨床診療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年5月至2020年4月武漢市漢口醫院45例老年原發性肝癌介入術后感染病人作為觀察組，另自同期住院的老年原發性肝癌介入術后未出現感染病人中通過SPSS 21.0統計軟件采取隨機數字表法抽取45例作為對照組。納入標準：（1）所有肝癌病人診斷標準依據《原發性肝癌診療規范（2011年）》［10］，感染定義：介入術后，病人在血液、痰液、腹腔積液或肝臟穿刺液中檢測到細菌感染，或出現發熱、白細胞升高等炎癥反應的臨床表現；（2）肝功能Child-Pugh A、B級，無遠處轉移；（3）未預防性使用抗生素；（4）未合并嚴重心、腎、肺功能不全等介入禁忌證；排除標準：（1）轉移性肝癌者；（2）既往胃腸道、膽道手術史者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集病人三類可能與介入術后感染相關的潛在危險因素，包括一般資料（年齡、性別）、術前檢查結果［乙型肝炎表面抗原（HB-sAg）、腹水、血紅蛋白、白蛋白、血小板、凝血酶原時間、膽紅素、谷氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、術中資料（腫瘤血供、異位栓塞、部分脾臟栓塞）］。

1.2.2 血清miR-200a、miR-221表達 空腹狀態下，抽取外周靜脈血5 mL，3 000 r/min高速離心處理10 min，離心半徑為15 cm，采用血液RNA提取試劑盒分離獲取RNA，采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA中的miRNA反轉錄為對應cDNA，采用miRNA熒光定量聚合酶鏈式反應檢測試劑盒配置反應體系，按照說明書設定反應程序對miR-200a、miR-221和U6進行擴增反應，自動生成擴增曲線后，以 U6 為內參基因，以 2-ΔΔCt計算 miR-200a、miR-221相對表達量。

1.3 統計學方法采用統計學軟件SPSS 21.0處理數據，計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗與夏皮羅-威爾克正態性檢驗，均確認具備方差齊性且近似服從正態布，以±s描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料用例（%）表示、χ2檢驗；采用logistic多因素回歸模型分析老年原發性肝癌病人介入術后感染影響因素；采用Spearman相關性分析血清miR-200a、miR-221表達與影響因素的關系；繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristiccurve，ROC）得到曲線下面積（areas under the curve，AUC），檢驗血清miR-200a、miR-221表達對老年原發性肝癌病人介入術后感染的預測價值；繪制卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier，KM），對比不同血清miR-200a、miR-221表達病人生存情況。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較觀察組腹水、白蛋白＜30 g/L、異位栓塞、部分脾臟栓塞比例高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 老年原發性肝癌介入術后感染及未感染組臨床資料對比

2.2 兩組血清miR-200a、miR-221表達兩組術前血清miR-200a、miR-221表達相比，差異無統計學意義（P＞0.05），術后，觀察組血清miR-200a表達低于對照組，miR-221表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 老年原發性肝癌介入術后感染及未感染組血清miR-200a、miR-221表達對比/± s

表2 老年原發性肝癌介入術后感染及未感染組血清miR-200a、miR-221表達對比/± s

組別對照組觀察組t值P值例數45 45 miR-200a術前4.54±1.09 4.62±1.13 0.34 0.733術后4.69±1.14 2.84±0.74 9.13＜0.001 miR-221術前9.24±2.31 9.65±2.08 0.89 0.379術后9.05±2.43 12.37±3.02 5.75＜0.001

2.3 老年原發性肝癌病人介入術后感染影響因素分析以老年原發性肝癌病人術后是否發生感染為因變量（賦值：否=0，是=1），將表1，2中篩查出的P＜0.05的因素作為自變量，進行logistic回歸分析，結果顯示腹水、白蛋白＜30 g/L、異位栓塞、部分脾臟栓塞、術后血清miR-200a、miR-221表達均為老年原發性肝癌病人介入術后感染影響因素（P＜0.05）。見表3。

表3 老年原發性肝癌病人介入術后感染影響因素分析

2.4 血清miR-200a、miR-221表達與影響因素的關系老年原發性肝癌介入術后感染病人術后血清miR-200a表達與腹水、異位栓塞、部分脾臟栓塞呈負相關關系，與白蛋白呈正相關關系（P＜0.05）；術后血清miR-221表達與腹水、異位栓塞、部分脾臟栓塞呈正相關關系，與白蛋白呈負相關關系（P＜0.05）。見表4。

表4 血清miR-200a、miR-221表達與影響因素的關系

2.5 血清miR-200a、miR-221表達對老年原發性肝癌病人介入術后感染的預測價值繪制ROC曲線，評價血清miR-200a、miR-221表達對老年原發性肝癌病人介入術后感染的預測價值，發現，二者聯合預測AUC最大，預測效能良好。見表5。

表5 血清miR-200a、miR-221表達對老年原發性肝癌病人介入術后感染的預測價值

2.6 生存曲線以ROC曲線中截斷值為界，將原發性肝癌病人分為血清miR-200a、miR-221高表達與低表達組，miR-200a高表達組3個月病死率低于低表達組，miR-221高表達組3個月病死率高于低表達組，差異有統計學意義（χ2=4.27，4.13，P＜0.05）。

3 討論

目前，TACE介入術已被公認為中晚期原發性肝癌首選治療方法，隨著該方法在各級醫院普及應用，其感染相關并發癥逐漸出現，受到臨床高度重視［11-13］。老年原發性TACE介入術后感染發生多由綜合因素引起，這種感染可能與栓塞后引起的宿主自身變化有關，如菌群移位、胃腸屏障改變、自身免疫力下降等［14］。本研究logistic回歸分析顯示，腹水、白蛋白、異位栓塞及同時行部分脾臟栓塞均為介入術后感染影響因素。腹水作為細菌生長良好的培養基，介入術后肝臟腫瘤壞死刺激腹膜炎性滲出，易引起腹腔感染。血清白蛋白作為反映機體一般營養狀況及肝臟儲備功能的重要指標，其水平下降，可致使抗體合成的各種酶減少，酶活性下降，機體免疫功能減退，感染風險增加。異位栓塞為肝癌介入術后主要嚴重并發癥之一，主要是因栓塞腫瘤肝外動脈血供導致，尤其是多次TACE后，肝外供血動脈成為肝癌主要血供，可引起組織壞死，誘發感染。介入術中同時行部分脾臟栓塞后，脾臟組織壞死、炎性水腫、大量滲出液刺激腹膜、膈肌，極易導致膈下膿腫及脾臟膿腫形成。因此，對于出現上述情況的病人，臨床需加以重視。

近年來，大量研究表明，細胞內非編碼的miRNA調節基因表達，影響細胞信號轉導通路，促進細胞增殖、凋亡等生物學過程［15-16］。miRNA可結合靶基因3，端非編碼區相應靶點，改變靶基因mRNA生物穩定性，誘導mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯過程，參與腫瘤、炎癥及免疫反應等多種生理病理過程［17-18］。原發性肝癌發生發展過程中，伴有miRNA表達異常，包括上調或下調，調節不同生物學效應［19-20］。miR-200 家族分為 miR-200a與 miR-200b兩個亞家族，其中miR-200a亞家族包括miR-200a與miR-141，定位于染色體1p36，為腫瘤細胞上皮間質轉變主要調節因子［21］。miR-200a表達缺失或下調后，下游靶基因Rho激酶（ROCK）2表達上調，Rho/ROCK信號傳導通路的活化可促進肌蛋白收縮，黏著斑轉換及應力纖維形成，從而促進腫瘤細胞的轉移［22］。以往研究證實，原發性肝癌病人miR-200a表達明顯下調［23］，充分說明miR-200a參與原發性肝癌發生、發展。本研究中，觀察組術后miR-200a較術前明顯下降，且低于對照組術后，提示原發性肝癌病人介入術后miR-200a繼續下調與感染有關。炎癥反應為介入術后感染的重要發病機制，有研究指出，miR-200a參與機體炎癥反應，可降低血管內皮細胞炎癥反應［24］。另有研究指出，miR-200a可通過抑制黏附分子表達，增加黏附抑制分子表達，進而抑制炎癥反應［25］。因此，本研究推測，老年原發性肝癌病人介入術后發生感染，炎癥反應劇烈，miR-200a表達明顯下調。

在癌癥相關miRNA研究中發現，miR-221在肝癌、胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞中表達明顯上調，呈現出一種“通用”癌基因特性［26］。miR-221位于X染色體p11.3約1 kb區域內，是通過堿基互補配對原則與靶mRNA結合，進而在轉錄后引起靶mRNA降解或抑制其翻譯成蛋白質，其作用機制可能是通過對Bmf、p27、DDIT4多種基因的調控來調節細胞周期及分化，抑制細胞凋亡，從而參與調控腫瘤形成［27］。原發性肝癌病人miR-221表達明顯上調，且研究表明其上調與病人臨床病理特征及總體生存率有關［28］，充分說明miR-221與原發性肝癌病人發生、發展及預后有關。本研究中觀察組術后miR-221較術前明顯升高，且高于對照組術后，提示原發性肝癌病人介入術后miR-200a繼續升高與感染有關。TLR-4/NF-κB作為機體內調節炎癥反應的關鍵途徑，有研究證實，miR-221可靶向影響該通路激活，進而通過其變化來激活炎癥反應，靶向影響炎癥細胞因子釋放［29］，故推測原發性肝癌介入術后感染與miR-221靶向激活炎癥反應有關。此外，本研究中，術后血清miR-200a、miR-221表達與老年原發性肝癌病人介入術后感染影響因素腹水、白蛋白、異位栓塞及同時行部分脾臟栓塞有關，提示血清miR-200a、miR-221表達參與介入術后感染發生、發展。基于此，本研究繪制ROC曲線，評價血清miR-200a、miR-221表達對老年原發性肝癌病人介入術后感染的預測價值，發現術后血清miR-200a、miR-221表達聯合預測介入術后感染，預測效能良好，且以ROC曲線中截斷值為界，將原發性肝癌病人分為血清miR-200a、miR-221高表達與低表達組，miR-200a高表達組3個月病死率低于低表達組，miR-221高表達組3個月病死率高于低表達組，推測術后血清miR-200a、miR-221表達可預測病人預后，但本研究樣本量較小，還需臨床多中心、多渠道取樣，作進一步證實。

綜上所述，老年原發性肝癌介入術后感染病人血清miR-200a表達明顯下調，miR-221顯著上調，臨床檢測其水平，可早期診斷感染，合理制定治療方案，有助于改善預后。