正交試驗優化神香草中的迷迭香酸和蒙花苷提取工藝

韓雪，李莉，劉佳倪，刁娟娟

神香草為唇形科（Labiatae）神香草屬（Hyssopus L.）硬尖神香草，嫩芽可以用來制茶，其茶具有幫助脂肪分解、消化的功效，葉也常常被用于烹調食物［1］。神香草揮發油中主要含有莰烯、蒎烯、蒎莰酮等成分［2-6］，被廣泛應用于化妝品、化工及食品香料等行業。此外神香草應用最普遍的是其藥用價值，是維吾爾民間常用中藥材，也是寒喘祖帕顆粒和羅歐咳祖帕的主要成分之一，野生神香草主要生長在新疆的阿勒泰等地，收載于《中國植物志》［7］、中華人民共和國衛生部藥品標準等，主治功能為化痰、止咳、祛風寒、殺菌，用于治療咳嗽、頭疼、哮喘及寒性引起的感冒［8-9］。部頒標準中只記載神香草的形狀等特征，對其鑒別檢查、含量測定均無明確規定。相關文獻報道，神香草中含有豐富的化學成分，主要包括揮發油、萜類、黃酮、酚酸、多糖等［10-14］，其中酚酸類成分迷迭香酸具有殺菌、抗炎、調節免疫及抗衰老的功效［15-16］。蒙花苷屬于黃酮類化合物，可以抗菌消炎［17-18］、并對慢性氣管炎有一定療效。前期課題組證實迷迭香酸和蒙花苷抗炎平喘的作用，同時又可以與市場中常出現的混淆品大苞荊芥加以區分，因此將迷迭香酸和蒙花苷作為本次實驗的指標成分。正交試驗設計是分式析因設計的方法之一，在研究多因素多水平的同時是尋求二者較優組合的一種簡單、高效、迅速的方法［19］。

本研究自2021年3—5月結合單因素試驗的結果，采用L9（34）正交試驗優化神香草中迷迭香酸和蒙花苷的提取工藝，并采用高效液相色譜法測定神香草中的主要成分迷迭香酸及蒙花苷的含量，為后續研究提供最優工藝條件，對其質量控制提供前期基礎。

1 儀器與藥材試劑

1.1 儀器數控超聲波清洗器（KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（AL-104，梅特勒-托利多儀器有限公司），分析天平（AB135-S，d=0.01/0.1 mg，Mettler-TeLedo），高效液相色譜儀（日本島津，LC-2AT），色譜柱（Sepax HPLC18，4.6 mm×250 mm 5 μm）。

1.2 藥材與試劑磷酸、乙腈均為色譜級；甲醇為分析級；迷迭香酸（批號111871-201706，中國食品藥品研究院），純度＞98%；蒙花苷（批號20210606，北京索萊寶科技有限公司），純度＞98%。

本次實驗用的神香草藥材產地主要為新疆各地區、州，由新疆醫科大學藥學院帕麗達教授鑒定，為正品硬尖神香草（Hyssopus officinalis）。

2 溶液的制備

2.1 對照品混合溶液的制備取迷迭香酸、蒙花苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1毫升各含10 μg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備取神香草粉末，精密稱定0.5 g，于具塞錐形瓶中，精密吸取60%甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3 色譜方法的建立

色譜柱為C18柱；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸，按乙腈（A）∶0.1%磷酸（B）為（25∶75）等度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL；檢測波長為330 nm。理論塔板數按迷迭香酸和蒙花苷計算均不得低于2 000，見圖1。

圖1 對照品及神香草樣品330 nm高效液相色譜圖：A為溶劑峰；B、C為對照品色譜峰；D為樣品峰

4 樣品處理方法

4.1 單因素試驗由于迷迭香酸是一種水溶性物質，蒙花苷幾乎不溶于水，二者極性差異較大，所以在實驗過程中采用綜合評分的方式評價迷迭香酸和蒙花苷提取效果，且神香草中迷迭香酸含量高于蒙花苷的含量，因此迷迭香酸權重系數占比高于蒙花苷的權重系數。

綜合評分=迷迭香酸含量/迷迭香酸最高含量×0.6+蒙花苷含量/蒙花苷最高含量×0.4。

4.1.1 提取方法的考察 取神香草藥材粉末（過篩）6份，分為兩組，每組平行操作3次，精密稱定各0.5 g，于具塞錐形瓶中，精密吸取25 mL甲醇，稱重，每組分別采用加熱回流和超聲法提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，以迷迭香酸、蒙花苷的綜合評分作為指標進行比較。結果顯示，超聲法提取效果最佳。結果見表1。

表1 提取方法對測定結果的影響（n=3）

4.1.2 提取溶劑的考察 取神香草藥材粉末 （過篩）24份，分為8組，每組平行操作3次，精密稱定各0.5 g，于具塞錐形瓶中，每組分別精密吸取25 mL甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇，稱重，超聲法提取30 min，放冷，補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，以迷迭香酸、蒙花苷的綜合評分作為指標進行比較。結果顯示，提取溶劑為60%甲醇時提取效果最佳。見表2。

表2 提取溶劑對測定結果的影響（n=3）

4.1.3 提取溶劑的用量的考察 取神香草藥材粉末（過篩） 12份，分為4組，每組平行操作3次，精密稱定各0.5 g，于具塞錐形瓶中，每組分別按料液比1∶10、1∶20、1∶50、1∶100精密吸取60%甲醇，超聲法提取30 min，放冷，補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，以迷迭香酸、蒙花苷的綜合評分作為指標進行比較。結果顯示，提取溶劑的加入量為25 mL提取效果最佳。結果見表3。

表3 料液比對測定結果的影響（n=3）

4.1.4 超聲處理時間的選擇 取神香草藥材粉末（過篩） 12份，分為4組，每組平行操作3次，精密稱定各0.5 g，于錐形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，采用超聲法分別提取10、15、20、30 min，放冷，補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，以迷迭香酸、蒙花苷的綜合評分作為指標進行比較。結果顯示，提取時間為20 min提取效果最佳。結果見表4。

表4 提取時間對測定結果的影響（n=3）

4.1.5 提取功率的考察 取神香草藥材粉末（過篩） 12份，分為4組，每組平行操作3次，精密稱定各0.5 g，于錐形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，超聲功率分別為150、250、350、500 W提取20 min，放冷，補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，以迷迭香酸、蒙花苷的綜合評分作為指標進行比較。結果顯示，提取功率為350 W提取效果相對較好。結果見表5。

表5 提取功率對測定結果的影響（n=3）

4.1.6 提取次數的選擇 取神香草藥材粉末（過篩）9份，分為3組，每組平行操作3次，精密稱定各0.5 g，于具塞錐形瓶中，精密吸取60%甲醇25 mL，采用超聲法分別提取1、2、3次（20分/次），放冷，補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，以迷迭香酸、蒙花苷的綜合評分作為指標進行比較。結果顯示，提取2次時提取效率最高，為提取方法操作方便簡單，故選擇提取次數為2次。見表6。

表6 提取次數對測定結果的影響（n=3）

4.2 提取工藝重復正交試驗結合單因素試驗的結果，以神香草中迷迭香酸和蒙花苷兩種成分含量的綜合評分作為考察指標，選擇對迷迭香酸、蒙花苷提取效果影響較大的提取溶劑（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，按照L9（34）正交表進行重復性正交試驗，確定其最優提取工藝。神香草因素水平見表7，試驗安排及結果見表8，方差分析結果見表9。

表7 正交試驗因素水平表

各因素水平的變化對實驗結果大小的影響可以通過各因素、水平的極差R值的大小直觀反映，極差值越大影響越大，反之越小。因此由表8分析結果中可以直觀看出四個因素對迷迭香酸和蒙花苷提取率影響的顯著性依次是：B＞C＞A＞D，料液比在本次試驗中是影響提取的最重要因素，其次是提取時間、提取溶劑，提取次數影響最小，最佳提取工藝為A1B1C1D1，即提取溶劑100%甲醇溶液、料液比1∶20、提取時間15 min、提取次數1次。從表9方差分析結果可知，因素B（料液比）、因素C（提取時間）差異有統計學意義（P＜0.05），而因素A（提取溶劑）、D（提取次數）差異無統計學意義。A因素兼顧藥材中迷迭香酸和蒙花苷的提取率，由于二者極性差異較大，迷迭香酸含量高于蒙花苷，因此選擇60%甲醇最合適，結合直觀分析和方差分析應該選擇A3B1C2D1，即提取溶劑60%甲醇溶液、料液比1∶20、提取時間20 min、提取次數1次。

表8 L9（34）正交試驗安排及結果（n=27）

表9 正交試驗方差分析表

4.3 最佳提取工藝條件驗證按上述神香草最佳提取工藝A3B1C2D1，即提取溶劑60%甲醇溶液、料液比1∶20、提取時間20 min、提取次數1次條件進行3次平行驗證試驗，結果見10。

表10 驗證試驗結果/%

5 討論

單因素試驗表明，各個因素在相互不影響的情況下提取神香草中迷迭香酸和蒙花苷的最佳條件為100%甲醇溶液、料液比1∶50、提取功率350 W、提取時間為20 min、提取次數2次。但在實際操作過程中各個因素存在相互影響的情況，考慮實際生產過程中所消耗時間和資源成本等系列問題，本次實驗選取操作簡便、快捷迅速的超聲提取法，故在超聲提取的基礎上，選取4個因素分別為提取溶劑、提取功率、提取時間和提取次數作為考察指標。正交試驗結果表明，提取溶劑的加入量是影響提取效果的占比重要的因素，其次為提取時間、提取溶劑，提取次數是最小的影響因素。