葡萄VlCKX4表達特性分析與轉錄調控預測

李旭飛，楊盛迪，李松琦，劉海楠，裴茂松，韋同路，郭大龍，余義和

葡萄表達特性分析與轉錄調控預測

李旭飛，楊盛迪，李松琦，劉海楠，裴茂松，韋同路，郭大龍，余義和*

河南科技大學園藝與植物保護學院/河南省園藝植物品質調控工程技術研究中心，河南洛陽 471023

【】通過克隆細胞分裂素脫氫酶/氧化酶基因及其啟動子，進行表達特性分析和啟動子活性分析并進行轉錄因子預測，為深入解析介導細胞分裂素信號途徑調控葡萄坐果的分子機制提供依據。【】使用生物信息學方法分析‘巨峰’葡萄(×)細胞分裂素氧化酶/脫氫酶4（）的序列特征；利用PCR技術克隆該基因以及它的啟動子，使用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)分析的表達特性，GUS活性試驗用于分析其啟動子活性；利用PlantTFDB、CisBP等轉錄調控數據庫對的轉錄調控關系進行預測分析，輸出結果使用Gephi軟件進行可視化。【】全長1 582 bp,其中包含1 566 bp的開放閱讀框，編碼522個氨基酸，具有家族特征的FAD結構域和細胞分裂素結合（ck-binding）結構域。qRT-PCR結果表明在花序中高表達，其次是葉片，在卷須中表達量最低；細胞分裂素CPPU處理后表達量先下降后上升，細胞分裂素抑制劑洛伐他汀(Lov)處理后表達量先上升后下降。順式元件分析表明啟動子中含有吲哚乙酸、茉莉酸甲酯等響應元件；GUS化學組織染色試驗表明，響應這些激素的處理。轉錄調控預測分析結果顯示，MYB、DOF和WRKY類轉錄因子對其進行轉錄調控，結合轉錄組數據和共表達關系確定、和為關鍵候選轉錄因子。【】葡萄受到細胞分裂素CPPU的誘導，啟動子受到和轉錄因子的調控，參與促進葡萄坐果過程。

‘巨峰’葡萄；細胞分裂素；；啟動子活性；調控

0 引言

【研究意義】葡萄是最古老的果樹之一，在世界范圍內廣泛種植。葡萄中富含多種營養物質，包括白藜蘆醇、原花青素，以及黃酮類物質，具有極高的營養價值，備受消費者喜愛[1-3]。據統計，2020年中國葡萄總種植面積達78.3萬hm2，其中鮮食葡萄占比32%[4]。在眾多的鮮食葡萄類型中，‘巨峰’（×）因其果實大、味道鮮美、抗病性好[5]、品質高等優點成為鮮食葡萄的主栽品種。在‘巨峰’葡萄的栽培過程中會出現3次生理落果，第一次最嚴重，平均落果率高達80%[6]，成為限制‘巨峰’葡萄栽培面積的主要因素之一，也給果農的栽培管理帶來了嚴峻的挑戰。【前人研究進展】坐果是果樹重要的性狀，是產量和品質的決定因素之一[7]。目前，生產中用于促進葡萄坐果的生長調節劑有赤霉素、細胞分裂素、油菜素內酯等[8]。其中，赤霉素主要促進細胞分裂以及中果皮細胞增大來使果實增大，最新的研究從基因調控層面表明，赤霉素能夠調節葡萄和的特異性表達，從而影響坐果，但會對葡萄花芽發育產生不利影響[9]。細胞分裂素是植物五大激素之一，通過調節擬南芥分生組織、胚珠等的形成，對擬南芥種子的產量進行調節[10-11]。人工合成的細胞分裂素6-BA通過提高葉綠素含量，提高光合性能，延緩葉片衰老[12]，從而增加玉米籽粒數。另外一種人工合成的細胞分裂素CPPU（forchlorfenuron, N-(2-chloro-4-pyridinyl)-N-phenylurea）促進坐果的效應更強[13-21]，在低濃度條件下就可促進葡萄的生長，并且能夠有效減少葡萄穗軸壞死，促進葡萄單性結實[6,22]。植物細胞分裂素氧化酶/脫氫酶(cytokinin oxidase/ dehydrogenase，CKXs)是植物體中存在的一種不可逆降解細胞分裂素的酶，因此，它對植物維持體內細胞分裂素穩態具有重要作用。一些CKX基因已經被證明與植物的生長發育相關，例如過表達擬南芥，導致擬南芥葉片變小，植株發育延緩，側根和花的數量顯著增加[23]。同樣，過表達可以增加初生根的生長速率以及不定根和側根的長度[10]；而表達量的增加會導致葉片變厚變硬。沉默水稻之后水稻分蘗數增加，產量也得到了提升[24-25]，也有研究表明的表達降低導致細胞分裂素在花序分生組織中積累并增加生殖器官的數量，從而提高谷物產量[25]。沉默也能提高水稻籽粒數，不同的是通過延緩葉片衰老起到提高產量的作用[26]。前期通過CPPU處理葡萄花序，發現葡萄坐果率提高40%左右[27]，說明CPPU在促進葡萄坐果功能上效果顯著。在花后第5天進行CPPU處理，在處理后的1、2、4和8 d采樣用于轉錄組測序并進行分析，結果顯示細胞分裂素脫氫酶/氧化酶（CKXs）家族基因表達量在處理和對照之間差異顯著。研究人員為驗證該基因家族在CPPU促進葡萄坐果過程中發揮的作用，進行了基因家族成員鑒定和表達量分析，基因家族鑒定結果顯示葡萄中CKX家族共有8個成員，均含有FAD結構域和CK結合結構域，且該家族絕大部分成員都受到CPPU的誘導，其中發現變化最為顯著[28]，暗示該基因可能發揮重要作用。【本研究切入點】使用植物生長調節劑CPPU是目前有效提高葡萄坐果率的方法，但其潛在的分子機制還不清楚。【擬解決的關鍵問題】從‘巨峰’葡萄基因組中克隆和它的啟動子，通過生物信息學分析、表達特性分析、GUS組織化學染色、轉錄調控預測等方法，對的功能以及轉錄調控模式進行初步探索，為后續進一步研究細胞分裂素促進坐果分子機制的解析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗材料為8年生的‘巨峰’葡萄（L.×L. Kyoho），種植于河南洛陽偃師葡萄種植區。處理時間為2019年5月18日，以10 mg?L-1的細胞分裂素（CPPU）和1.62 g·L-1的細胞分裂素合成抑制劑洛伐他汀（Lov）對盛花后5 d的葡萄花序進行處理，處理方式為浸蘸，時間為15 s，以清水處理作為對照。采樣時間為處理后1、2、4和8 d。采集后的果實在液氮中速凍，-80℃冷藏備用。本試驗所用的引物見表1，由金唯智生物科技有限公司（江蘇，中國）合成。

表1 在本研究中使用到的引物

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取與使用RNA提取試劑盒（天根生物，北京）提取‘巨峰’葡萄RNA，使用反轉錄試劑盒（Takara，大連）獲得葡萄果實全長cDNA，以此為模板，擴增得到全長（Vitvi11g01371）。擴增使用50 μL體系：正反向引物FL-F/R各1 μL、高保真酶（PrimeSTAR Max Premix，Takara，大連）25 μL、ddH2O 19 μL、模板2 μL。反應程序：98℃預變性2 min、98℃變性10 s、58℃復性30 s、72℃延伸150 s、共35個循環，然后在72℃條件下繼續延伸10 min。獲得的產物經瓊脂糖凝膠電泳（1.0%）檢測后使用膠回收試劑盒（康為世紀，北京）回收目標片段，經蘇州金唯智公司測序得到序列。

1.2.2 實時熒光定量PCR 使用反轉錄試劑盒（諾唯贊，南京）進行反轉錄獲取片段cDNA，經內參基因（GenBank：CA808925）檢測后在-40℃保存備用。RT-qPCR反應體系為10 μL：QT-F/R各0.3 μL、ddH2O 3.4 μL、2×TransStart? Top Green qPCR Super Mix 5 μL。反應在Bio-Rad IQ5Real-Time PCR檢測（Bio-Rad Laboratories, Hercules CFX96 Touch，CA, USA）儀器上進行，使用兩步法程序：94℃ 30 s、94℃ 5 s、60℃退火30 s，共循環40次，每個樣品設置3次重復。采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量，并使用Excel、SPSS軟件對所得數據進行分析。

1.2.3 啟動子的克隆與載體構建 采用改良CTAB法[29]提取葡萄果實的DNA。使用同源重組[30]的方法進行載體構建。使用添加同源臂的引物，以DNA為模板，使用高保真酶PrimerSTAR Max Premix（Takara，大連）擴增目的基因的啟動子區域。同時對載體pC0390-35S-GUS進行雙酶切，使用的限制性內切酶為R I和d III（Takara，大連）。使用無縫克隆試劑盒Seamless Cloning Kit（碧云天，上海）將回收的目的基因產物與載體進行連接，使用20 μL連接體系，按照說明書的程序進行操作。之后，將連接產物轉化進大腸桿菌感受態（）中，涂在添加抗生素的培養基上培養用于篩選陽性克隆，挑選單克隆菌落至渾濁，進行菌液PCR以及提質粒做酶切鑒定，后送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。測序完成后將質粒轉化至農桿菌感受態GV3101中。以pC0390-GUS載體為陰性對照，帶有35S啟動子的GUS載體作為陽性對照，使用農桿菌介導的煙草瞬時轉化法，進行GUS組織化學染色試驗。

1.2.4 煙草瞬時轉化及GUS組織化學染色 利用真空滲透方法進行煙草葉片的瞬時轉化。在浸染之后，分別用GA3（200 μmol·L-1）、脫落酸（ABA）（100 μmol·L-1）、茉莉酸甲酯（MeJA）（100 μmol·L-1）、CPPU（40 μmol·L-1）噴施煙草葉片，之后正常光照條件下培養24 h。將培養好的煙草葉片放進一次性培養皿中，加入GUS染色劑（華越洋生物，北京），使葉片完全浸入，放在37℃培養箱中過夜培養，期間使用封口膜將容器封閉避免GUS染色液揮發。后使用70%乙醇脫色6—8 h，80%乙醇脫色9 h，期間可多次更換乙醇，直到綠色完全脫去，觀察GUS染色情況并拍照記錄。

1.2.5 靶向的轉錄因子調控預測 利用PlantTFDB4.0數據庫葡萄轉錄因子信息，用Hmmscan對參考基因組葡萄基因組序列（http://plants.ensembl.org/index.html）中的所有基因進行轉錄因子家族分析，通過Blast 進行轉錄因子注釋，截取 Hmmscan E- value≤0.05、Blast E-value≤0.05為標準鑒定并統計所有轉錄因子（表2）。提取Ensembl數據庫中葡萄的GFF3注釋文件和葡萄基因組文件中的啟動子序列（上游2 000 bp）作為預測富集背景，并提交給PlantTFDB和Cis-bp數據庫進行調控預測（http://plantregmap.gao-lab.org）。FIMO用于判斷啟動子中的TF結合位點，根據10-5為截取閾值篩選預測結果。獲取預測信息并將其導入Gephi0.9.2軟件，并使用“Fruchterman Reingold”布局將數據可視化，并計算節點的平均權重，以區分節點的關鍵程度。

表2 靶向VlCKX4的轉錄因子預測

1.2.6理化性質分析及進化樹構建 使用在線網站Expasy（https://www.expasy.org/#opennewwindow）分析VlCKX4的理化性質，使用在線網站TMHMM（https://www.psc.edu/user-resources/software/tmhmm）預測VlCKX4蛋白跨膜結構，使用在線網站PSORT （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0）預測的亞細胞定位。將已經獲得的VlCKX4氨基酸序列在NCBI數據庫進行BLAST比對，并使用MAGA7軟件將葡萄的序列與其他植物的序列進行ClustalW比對，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，自展值（Boot-strap）設置為1 000。

1.2.7 基因轉錄因子共表達關系預測 使用R包（GINE3），并使用隨機森林（Random Forest）模型，計算基因和轉錄因子之間表達量的相關性，并將該相關性值體現在靶向關系圖中轉錄因子的節點大小上，基因與轉錄因子之間相關性越強，節點越大；反之，相關性越弱，節點越小。

2 結果

2.1 VlCKX4克隆及生物信息學分析

前期通過對細胞分裂素促進坐果的轉錄組進行分析發現，細胞分裂素氧化酶/脫氫酶（CKXs）基因家族在葡萄坐果過程中發揮重要作用，其中在處理和對照組前期差異最顯著。為進一步對的功能進行探究，使用FL-F/R引物擴增到全長（圖1-A）。開放閱讀框（ORF）長度為1 566 bp，編碼521個氨基酸，具有CKXs特征結構域-細胞分裂素結合位點（CK-binding）和核黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）（圖2-A）。氨基酸序列分析發現，VlCKX4屬于穩定蛋白，分子質量為58.1 kD，理論等電點（PI）為6.68，不穩定系數和脂肪系數分別為32.42、95.05。亞細胞定位預測結果表明VlCKX4所在的位置屬于胞外。進化樹結果顯示，VlCKX4與茶樹、煙草等在同一分枝，說明葡萄VlCKX4和茶樹的CKX同源性最高，其次是煙草（圖2-B）。

Marker: DL2000

圖2 VlCKX4結構示意圖和進化樹

2.2 VlCKX4表達特性分析

檢測‘巨峰’根、莖、葉、花、卷須中的表達情況，結果顯示在葡萄花序中高表達，其次是葉和莖，在卷須中表達量最低（圖3-A）。檢測自然發育時期和CPPU處理后同一時期的果實中的表達情況，結果顯示，在CPPU處理后表達受到顯著誘導，在處理后第2天（D2）表達量達到峰值，在處理后第1天（D1）、處理后第4天（D4）、處理后第8天（D8）均顯著上調（圖3-B）。而Lov處理后葡萄呈現下調趨勢，并且在D4和D8階段顯著下調（圖3-C）。

2.3 VlCKX4啟動子克隆及順式作用元件分析

使用引物Pro-F/R克隆得到了5′端上游2 075 bp序列（圖1-B）。使用PlantCARE網站對啟動子序列進行預測分析，結果表明該啟動子區域存在多個順式作用元件，除了核心的元件TATA-box以及增強元件CAAT-box外，還包括節律調節、低溫逆境響應等元件。在的啟動子區域發現多種植物激素的響應元件，包括脫落酸（ABA）、生長素、赤霉素（GA3）、茉莉酸甲酯（MeJA）等激素的響應元件，其中跟茉莉酸甲酯響應相關的元件數量最多，其次是跟脫落酸響應相關的元件（表3）。

*: P＜0.05; **: P＜0.01; ***: P＜0.001

表3 VlCKX4啟動子順式作用元件預測

2.4 VlCKX4啟動子活性分析

與對照相比，顯著增強了GUS基因的活性。此外，分別用GA3、IBA、ABA、CPPU、MeJA等植物生長調節劑噴施到煙草葉片中并進行GUS染色，結果顯示的啟動子活性受到上述這些植物生長調節劑的影響（圖4）。其中CPPU對它的啟動子增強效果最為明顯，其次是ABA。

圖4 植物生長調節劑處理后GUS組織化學染色

2.5 靶向VlCKX4的轉錄因子調控網絡預測

利用PlantTFDB和CisBP數據庫對靶向的轉錄因子進行預測，以10-5為閾值截取，共獲得27個可能參與葡萄坐果過程的轉錄因子（表2），繪制Treemap圖顯示調控的轉錄因子類型主要有MYB類、WRKY類、DOF類等，其中MYB類最多，其次是WRKY、MAKC和DOF類（圖5-A）。將這些轉錄因子信息導入Gephi0.9.2軟件，個數大于1的每一類轉錄因子賦予一種顏色。并且依據轉錄組數據中的FPKM值，利用R包GINE3中的隨機森林模型計算出與這些轉錄因子的共表達系數，系數越高，共表達關系越強。節點的大小反映該轉錄因子與基因共表達關系的強弱。結果表明，對靶向效應強且與具有較強共表達關系的是的分別為、、、、和（圖5-B）。為了進一步縮小范圍，依據CPPU轉錄組數據，挑選在坐果過程中差異表達（log2FC≥1或log2FC≤-1）的轉錄因子，并分別以-adjust值和log2FC（Fold change）值為依據繪制熱圖，結果顯示、、、、、、、在轉錄組中差異顯著（圖5-C）。綜上，可能受到多種轉錄因子的調控，同時結合靶向關系預測和轉錄組數據，、、為關鍵候選轉錄因子，可能在CPPU促進坐果的過程中起關鍵的調控作用。

3 討論

3.1 VlCKX4參與細胞分裂素介導的葡萄坐果

細胞分裂素在調節植物生長發育方面發揮重要作用。CKX是在體內發揮不可逆降解細胞分裂素功能的一種酶，因此，這個酶對于維持植物體內細胞分裂素的穩定十分重要。CKXs家族的特征結構域為CK結合結構域以及FAD結合結構域[31]，分別位于C端和N端。本研究對的氨基酸序列進行分析,發現它具有完整的兩個特征結構域，這表明可以編碼有功能的蛋白，并因此參與到細胞分裂素的生物代謝進程。同時，進化樹分析結果表明在進化過程中具有比較高的保守性。

課題組前期分別使用CPPU和Lov處理‘巨峰’葡萄花序，CPPU處理后坐果率顯著提高，Lov處理后坐果率顯著降低。與其相對應地，的表達水平在CPPU處理后顯著升高，在Lov處理后顯著降低。此外，Lov處理后呈現出先上升后下降的趨勢，在D1上調，D2、D4、D8下調，表明不僅受細胞分裂素調控，還受到其他因素的誘導，因此，該基因表達量在細胞分裂素含量下降之后，仍能有所上升。

A：調控VlCKX4的轉錄因子富集，面積越大，代表該類型轉錄因子越多，顏色代表調控關系的強弱；B：VlCKX4的靶向關系圖，圓圈與圓圈之間的連線代表具有靶向關系，相同的顏色代表同種類型轉錄因子，少于一個的統一使用灰色。共表達關系的強弱體現在節點的大小上，節點越大，該轉錄因子與VlCKX4的共表達關系越強，反之亦然

3.2 VlCKX4響應多種激素處理，參與到激素串擾過程

植物基因表達調控包括轉錄和翻譯水平，前者主要是由順式作用元件和轉錄因子介導[32-34]，順式作用元件已經被證明與基因響應外界多種刺激相關[35-37]。因此，對于啟動子區域的研究對了解基因轉錄調控機制至關重要。啟動子是基因結構的重要組成部分，影響了基因的轉錄起始時間、表達水平以及空間位置。本研究克隆得到起始密碼子ATG上游2 075 bp的啟動子序列，順式作用元件分析發現該基因包含多個與植物激素響應相關的元件。除此之外，還有環境相關的元件，這暗示的表達可能受外界激素以及環境變化的影響，這與大多數CKXs基因家族的研究結果一致。在外源施加CPPU后，的啟動子活性與對照相比顯著增強，說明能夠明顯響應外源CPPU處理，這與CPPU處理之后的表達水平提高結果一致，也表明參與到細胞分裂素介導的促進葡萄坐果的過程。之前有研究發現細胞分裂素與生長素、赤霉素之間存在一定的串擾現象[38]，在本研究中，使用赤霉素、生長素等激素處理也能使的啟動子活性得到增強，也暗示受這些激素的影響，參與到多種激素通路中發揮作用。

3.3 MYB39、MYB306等是潛在靶向VlCKX4的轉錄因子

利用基因之間的共表達關系對植物中存在的調控關系進行轉錄調控預測，已經成為研究基因和轉錄因子調控關系的一種重要手段。在葡萄冷應激反應中，通過共表達網絡分析找到可能是的下游靶點，參與到該應激過程[39]。此外，在葡萄響應干旱脅迫研究中，也通過轉錄結合位點預測，篩選到15個可能調控AQPs的關鍵轉錄因子[40]。本研究通過分析靶向轉錄因子的調控網絡和轉錄因子結合啟動子的預測位點，篩選出27個可能調控的關鍵轉錄因子，它們分別屬于MYB、WRKY、DOF、MAKC轉錄因子家族，MYB作為植物中最大的轉錄因子家族之一，與植物生長發育和其他生理過程相關[41]。煙草中15個CKX基因的系統發育關系已經被闡明，通過對它們啟動子上游分析發現在CKX中也含有大量的MYB順式作用元件，且對外源ABA和鹽脅迫都有反應[42]。此外，擬南芥在細胞分裂素反應中的全基因組表達譜分析結果表明，細胞分裂素在早期反應期間誘導不同類型的轉錄因子，其中就包括兩種MYB和兩種WRKY[39]。通過共表達關系篩選到的轉錄因子進一步結合轉錄組表達量數據進行縮小范圍，最終鎖定、、、、和這六個轉錄因子，作為調控的關鍵轉錄因子后續可進行功能驗證。

4 結論

對CPPU促進坐果轉錄組分析，篩選到了關鍵的。通過對其啟動子區域進行克隆和分析，發現該基因受赤霉素、脫落酸等激素的顯著誘導。此外，通過轉錄預測手段和轉錄組表達量相結合，推測、、和可能在CPPU促進坐果的過程中起關鍵的調控作用。

[1] OKATAN V. Antioxidant properties and phenolic profile of the most widely appreciated cultivated berry species: A comparative study. Folia Horticulturae, 2020, 32(1): 79-85.

[2] SOVAK M. Grape extract, resveratrol, and its analogs: a review. Journal of Medicinal Food, 2001, 4(2): 93-105.

[3] YU Y H, BIAN L, YY K K, YANG S D, GUO D L.functions as a transcriptional activator and enhances drought stress resistance via suppression of reactive oxygen species. Journal of Berry Research, 2020, 10(4): 547-558.

[4] YU Y H, MENG X X, GUO D L, YANG S D, ZHANG G H, LIANG Z C. Grapevine U-box E3 ubiquitin ligasenegatively regulates fruit ripening by facilitating abscisic- aldehyde oxidase degradation. Plant and Cell Physiology, 2020, 61(12): 2043-2054.

[5] GUO D L, XI F F, YU Y H, ZHANG X Y, ZHANG G H, ZHONG G Y. Comparative RNA-Seq profiling of berry development between table grape ‘Kyoho’ and its early-ripening mutant ‘Fengzao’. BMC Genomics, 2016, 17(1): 795.

[6] ZABADAL T J, BUKOVAC M J. Effect of CPPU on fruit development of selected seedless and seeded grape cultivars. HortScience, 2006, 41(1): 154-157.

[7] QUINET M, BUYENS C, Dobrev P I, MOTYKA V, JACQUEMART A L. Hormonal regulation of early fruit development in european pear (cv. ‘Conference’). Horticulturae, 2019, 5(1). doi: 10.3390/horticulturae5010009.

[8] SARKAR M D, SHAH M, KABIR M H. Flower and fruit setting of summer tomato regulated by plant hormones. Applied Science Reports, 2014, 7: 117-120.

[9] HWANG I. Cytokinin signaling networks. Annual review of plant biology, 2012, 63: 353-380.

[10] Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmülling T. Cytokinin-deficient transgenicplants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. The Plant Cell, 2003, 15(11): 2532-2550.

[11] BECHTOLD N, BOUCHEZ D. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adultplants by vacuum infiltration. Gene Transfer to plants, 1995:19-23.

[12] KRIZEK B A. Making bigger plants: Key regulators of final organ size. Current Opinion in Plant Biology, 2009, 12(1): 17-22.

[13] KOPECNY D, BRIOZZO P, POPELKOVA H, SEBELA M, KONCITIKOVA R, SPICHAL L, NISLER J, MADZAK CATHERINE, FREBORT I, LALOUE M, HOUBA H N. Phenyl- and benzylurea cytokinins as competitive inhibitors of cytokinin oxidase/dehydrogenase: A structural study. Biochimie, 2010, 92(8): 1052-1062.

[16] SMITH R. Effects of CPPU, a synthetic cytokinin, on fruit set and yield. Sonoma Ctry Grape Day, 2008, 7: 2008.

[17] CURRY E A, GREENE D W. CPPU influences fruit quality, fruit set, return bloom, and preharvest drop of apples. HortScience, 1993, 28(2): 115-119.

[18] NIMBOLKAR P K, RAI P N, MISHRA D S, Singh S K, SINGH A K, KUMAR J. Effect of CPPU, NAA and salicylic acid on vegetative growth, fruit retention and yield of pear [(Burm.) Nakai] cv Gola. Environment and Ecology, 2016, 34(2): 462-465.

[19] ASSAD S A. Effect of CPPU on fruit set, drop, yield and fruit quality of Hollywood and Santarosa plum cultivars. Egyptian Journal of Horticulture, 2013, 2(40): 187-204.

[20] CHEN L, ZHAO J, SONG J C, JAMESON P E. Cytokinin dehydrogenase a genetic target for yield improvement in wheat. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18 (3): 614-630.

[21] ANTOGNOZZI E, FAMIANI F, PROIETTI P, TOMBESI A, FRENGUELLI G. Effect of CPPU (Cytokinin) treatments on fruit anatomical structure and quality in actinidia deliciosa. Acta Horticulturae, 1997, 444(2): 459-465.

[22] LEWIS D H, BURGE G K, HOPPING M E, JAMESON P E. Cytokinios and fruit development in the kiwifruit () effects of reduced pollination and CPPU application. Horticultural Science, 1996, 98(1): 187-195.

[23] K?LLMER I, NOVáK O, STRNAD M, SCHMüLLING T, WERNER T. Overexpression of the cytosolic cytokinin oxidase/ dehydrogenase () fromcauses specific changes in root growth and xylem differentiation. The Plant Journal, 2014, 78(3): 359-371. doi: 10.1111/tpj.12477.

[24] ASHIKARI M, SAKAKIBARA H, LIN S, YAMAMOTO T, TAKASHI T, NISHIMURA A, ANGELES E R, QIAN Q, KITANO H, MATSUOKA M. Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science, 2005, 309(5735): 741-745. doi: 10.1126/science. 1113373.

[25] TSAI Y C, WEIR N R, HILL K, ZHANG W J, KIM H J, SHIU S H, SCHALLER G E, KIEBER J J. Characterization of genes involved in cytokinin signaling and metabolism from rice. Plant Physiology, 2012, 158(4): 1666-1684. doi: 10.1104/pp.111.192765.

[26] ZHANG W, PENG K X, CUI F B, WANG D L, ZHAO J Z, ZHANG Y H, YU N N, WANG Y Y, ZENG D L, WANG Y H, ZHENG Z K, ZHANG K W. Cytokinin oxidase/dehydrogenasecoordinates source and sink relationship in rice by simultaneous regulation of leaf senescence and grain number. Plant Biotechnology Journal, 2020, 19(2): 335-350.

[27] YU Y H, LI X F, YANG S D, BAN L, YU K K, MENG X X, LIU H N, PEI M S, WEI T L, GUO D L. CPPU-induced changes in energy status and respiration metabolism of grape young berry development in relation to Berry setting. Scientia Horticulturae, 2021, 283: 110084.

[28] YU K K, YU Y H, BIAN L, NI P Y, YANG Y J. Genome-wide identification of cytokinin oxidases/dehydrogenase (CKXs) in grape and expression during berry set. Scientia Horticulturae, 2021, 280(223): 109917.

[29] 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術. 北京: 高等教育出版社, 2000.

LI H S. Principles and Techniques of Plant Physiological and Biochemical Experiments. Beijing: Higher Education Press, 2000. (in Chinese)

[30] CLOUGH S J, BENT A F. Floral dip: A simplified method for-mediated transformation of. The Plant Journal, 1998, 16(6): 735-743. doi: 10.1046/j.1365-313x.1998. 00343.x.

[31] GU R L, FU J J, GUO S, DUAN F Y, WANG Z K, MI G H, YUAN L X. Comparative expression and phylogenetic analysis of maize cytokinin dehydrogenase/oxidase (CKX) gene family. Journal of Plant Growth Regulation, 2010, 29(4): 428-440. doi: 10.1007/s00344- 010-9155-y.

[32] LIU L X, WANG W Q, YANG J, ZHANG Y, ZHANG G Y, MA Z Y, WANG X F. Molecular cloning ofpromoters fromand G. hirsutum and functional analysis inresistance. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2018, 135(3): 535-544.

[33] MENG X B, ZHAO W S, LIN R M, WANG M, PENG Y L. Identification of a novel rice bZIP-type transcription factor gene, OsbZIP1, involved in response to infection of Magnaporthe grisea. Plant Molecular Biology Reporter, 2005, 23(3): 301-302. doi: 10.1007/BF02772762.

[34] WANG C H, GAO G, CAO S X, XIE Q J, QI H Y. Isolation and functional validation of the CmLOX08 promoter associated with signalling molecule and abiotic stress responses in oriental melon,var.Makino. BMC Plant Biology, 2019, 19(1): 75. doi: 10.1186/s12870-019-1678-1.

[35] CHEN C L, YUAN F, LI X Y, MA R C, XIE H. Jasmonic acid and ethylene signaling pathways participate in the defense response of Chinese cabbage to Pectobacterium carotovorum infection. Journal of Integrative Agriculture, 2021, 20(5): 1314-1326.

[36] VLOT A C, DEMPSEY D A, KLESSIG D F. Salicylic Acid, a multifaceted hormone to combat disease. Annual Review of Phytopathology, 2009, 47: 177-206. doi: 10.1146/annurev.phyto. 050908.135202.

[37] LI F F, ZHANG L, JI H K, XU Z Y, ZHOU Y, YANG S S. The specific W-boxes ofpromoter bound byare involved in drought stress response in wheat. Plant Science, 2020, 296: 110460. doi: 10.1016/j.plantsci.2020.110460.

[38] CONG L, WU T, LIU H T, WANG H B, ZHANG H Q, ZHAO G P, WEN Y, SHI Q R, XU L F, WANG Z G. CPPU may induce gibberellin-independent parthenocarpy associated with

[39] WANG Z M, WONG D C J, WANG Y, XU G Z, REN C, LIU Y F, KUANG Y F, FAN P G, LI S H, XIN H P, LIANG Z C. GRAS-domain transcription factor PAT1 regulates jasmonic acid biosynthesis in grape cold stress response. Plant Physiology, 2021, 186(3): 1660-1678. doi: 10.1093/plphys/kiab142.

[40] 楊盛迪, 郭大龍, 裴茂松, 劉海楠, 韋同路, 余義和. 干旱脅迫下葡萄AQP基因家族的鑒定及轉錄調控網絡預測. 果樹學報, 2021, 38(10): 1638-1652.

YANG S D, GUO D L, PEI M S, LIU H N, WEI T L, YU Y H. Identification of grapevine AQP family and prediction for transcriptional regulatory network under drought stress. Journal of Fruit Science, 2021, 38(10): 1638-1652. (in Chinese)

[41] 牛義嶺, 姜秀明, 許向陽. 植物轉錄因子MYB基因家族的研究進展. 分子植物育種, 2016(8): 2050-2059.

NIU Y L, JIANG X M, XU X Y. Reaserch advances on transcription factor MYB gene family in plant. Molecular Plant Breeding, 2016(8): 2050-2059. (in Chinese)

[42] CHEN W, Wang G, Yi M. Whole-Genome identification and salt-and aba-induced expression trends of theCKX gene family. Research Square, 2021: 1-17.

Analysis ofExpression Characteristics and Prediction of Transcriptional Regulation in Grape

LI XuFei, YANG ShengDi, LI SongQi, LIU HaiNan, PEI MaoSong, WEI TongLu, GUO DaLong, YU YiHe*

College of Horticulture and Plant Protection, Henan University of Science and Technology/Henan Engineering Technology Research Center of Quality Regulation and Controlling of Horticultural Plants, Luoyang 471023, Henan

【】The cytokinin dehydrogenase/oxidaseand its promoter in grape () were cloned to analyze the expression characteristics, promoter activity and transcription factor prediction, so as to provide a basis for the molecular mechanism thatinvolved in cytokinin-mediated berry set in grape. 【】The gene sequence of cytokinin oxidase/dehydrogenase 4 () in Kyoho grape (×) was studied by bioinformatics method. The gene and its promoter were cloned by PCR. The expression characteristics ofwere analyzed by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). GUS activity assay was used to analyze the promoter activity. The transcriptional regulatory relationship ofwas predicted by PlantTFDB, CisBP databases, and the output results were visualized by Gephi software. 【】The total length ofwas 1 582 bp, which contained 1 566 bp open reading frame (ORF), encoded 522 amino acids, and had the family characteristic FAD domain and cytokinin binding (CK-binding) domain. qRT-PCR results showed thatwas highly expressed in inflorescence and leaf, but the expression of tendril was lowest. The expression ofdecreased first and then increased after treatment with cytokinin (CPPU), while the expression ofincreased first and then decreased after treatment with the cytokinin inhibitor lovastatin (Lov). Cis-element analysis showed that thepromoter contained response elements of methyl jasmonate (MeJA) and other hormones. GUS histochemical staining showed thatresponded to the hormones. Predictive analysis of transcriptional regulation showed that MYB, DOF and WRKY transcription factors were involved in transcriptional regulation of. Combined with transcriptomic expression data and coexpression relation,,andwere identified as key candidate transcription factors. 【】was induced by CPPU and participates in the process of promoting grape berry set, during which prediction was regulated by transcription factors, such as,and.

Kyoho; Cytokinin;; promoter activity; regulation

2022-03-19；

2022-07-19

國家自然科學基金（32072517）、河南省高校科技創新人才支持計劃（21HASTIT035）、河南省高校科技創新團隊支持計劃（21IRTSTHN021）、洛陽市科技發展計劃（2101102A）

李旭飛，E-mail：lixufei8023 @163.com。通信作者余義和，E-mail：yuyihe@haust.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）