木霉菌在月季土壤條件下的定殖能力比較

徐傳訓

（聊城大學，山東 聊城 252000）

木霉菌屬于真菌門，半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，木霉屬[1]，它主要存在于土壤中，是土壤中重要的微生物群落[2]。對木霉菌株進行改良、選育不但能使其在農藥、肥料等不利條件下更好地生存，而且可提高木霉菌株的生防能力，也是目前的研究熱點之一[3]。木霉菌在土壤的定殖過程中會受到很多因素的影響，比如土壤營養物質、土壤微生物和培養天數等，其中土壤營養物質和培養天數是限制木霉菌定殖的主要因素[4-7]。針對此問題，根據月季土壤的理化性質下對兩種木霉菌絲生長和產孢量的影響，篩選出生防效力及定殖能力較高的菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養

供試菌種為長枝木霉（T.longissima）SMF2和哈茨木霉（T.harzianum）T39。采用PDA培養，在基于25±1 ℃的條件培養。

1.2 培養時間設定

培養液為PD培養液，時間處理以3天為起始，每2天為一個周期，培養到第15天，培養天數分別是3、5、7、9、11、13、15。

1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基：新鮮的馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然狀態進行配制。

固體培養基：測定土樣0.3 g、蒸餾水30 mL、瓊脂0.6 g進行配制。

液體培養基：蒸餾水100 mL、土樣1 g進行配制。

PDA培養基接上木霉菌的菌餅后，放在恒溫培養箱中在25±1 ℃并且要求黑暗條件和光照條件各12 h的條件下培養3天備用。

1.4 儀器

JM-A10002電子天平、PHS-3C型pH計、OLYMPUS生物顯微鏡BX51、MSL-3750高溫蒸汽滅菌鍋、BS-2E震蕩培養箱、SPX-50B全自動智能型生化培養箱、RE52CS旋轉蒸發器、B-220恒溫水浴鍋、SW-CJ-2FD凈化工作臺、CMAX PLUS酶標儀、火焰分光光度計。

1.5 供試藥品

0.136 mol/L硫酸重鉻酸鉀（K2Cr2O7-H2SO4）的標準溶液、0.2 mol/L硫酸亞鐵（FeSO4）標準溶液、鄰啡羅啉（鄰二氮菲）指示劑、1.8 mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液、1.2 mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液、2%硼酸溶液、0.01 mol/L鹽酸標準溶液、定氮混合指示劑、凡士林、粉末硫酸亞鐵（FeSO4）、濃硫酸、飽和重鉻酸鉀（K2Cr2O7）溶液、40%氫氧化鈉（NaOH）溶液、2%硼酸溶液、定氮混合指示劑、0.02mol/L鹽酸標準溶液、活性炭、硫酸鉬銻抗混合顯色劑、H中性1.0 mol/L醋酸銨（NH4OAc）溶液、K標準溶液。

1.6 試驗方法

1.6.1 菌種活化

將保存的哈茨木霉T39和長枝木霉SMF2菌株接種到PDA平板，活化5~9天，備用。

1.6.2 菌絲及孢子變化

將已活化的菌種按直徑為5 mm的小菌塊分別接種于不同土壤培養基中，然后置于28 ℃培養箱里避光培養。試驗設3個處理，每個處理設3次重復，每12 h觀察并測量菌絲生長情況。菌絲生長的速度（mm/d）=（菌落的直徑-菌種塊直徑）/菌落生長的時間，結果取平均值。

將菌種制成孢子懸浮液，在液體培養基接菌后的第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分別把接菌的土樣用濾紙過濾并放入烘箱內烘干，同時對濾液中的孢子數進行計數，并選出木霉菌繁殖最快的天數。

1.6.3 土壤樣品的采集

分別在月季園用“S”形取樣法，采集0~20 cm耕層土壤樣品，風干、研磨過篩，用于供試地土壤常規養分分析。

1.6.4 土壤養分含量測定

堿解氮的測定采用堿解擴散法，速效鉀的測定采用醋酸銨-火焰光度計法，速效磷的測定采用碳酸氫銨法，有機質的測定采用重鉻酸鉀法。

1.6.5 數據統計

利用Microsoft Excel 2020軟件處理數據，采用DPS數據處理系統9.01中的Duncan法進行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤對木霉菌生長速率的影響

由表1可知，月季土壤對哈茨木霉和長枝木霉菌絲生長有促進作用。

表1 生長速率

2.2 土壤對木霉菌產孢量的影響

木霉菌的孢子量是一直在上升的，哈茨木霉的孢子量大于長枝木霉的孢子量。哈茨木霉主要增加孢子量，長枝木霉主要增加菌絲量。

在培養4天的條件下，哈茨木霉T39的產孢量高于長枝木霉SMF2。木霉菌在土壤中第7天的孢子增長率最高，其余天數的孢子增長率相差不大。這就說明木霉菌在土壤中第7天達到繁殖的高峰，此時木霉菌活性最高，防治效果最好，此時也是木霉菌最佳的定殖時間。此外，兩種木霉菌相比而言，哈茨木霉T39的產孢量和孢子增長率均高于長枝木霉SMF2。

2.3 木霉菌培養過程中的形態特征

根據設計的試驗，月季土壤培養基的木霉菌絲生長最快、產孢最多。長枝木霉在PD培養基中以菌絲生長為主，且含月季土的PD培養基中的菌絲量大于不含土的PD培養基，因此，月季土壤有利于長枝木霉的生長。

2.4 土壤養分含量與木霉菌生長繁殖的關系

有機質含量隨著木霉菌的生長呈現下降與升高的趨勢。表明不僅植物的生長需要有機質，木霉菌的生長同樣需要，所以培養基中會出現有機質含量下降的情況。隨著時間的增加，木霉菌的數量在不斷增加。木霉菌本身就是有機質，木霉菌繁殖得越快越多，有機質的含量就會增多。

由于木霉菌自身的活動增加了堿解氮的含量，導致堿解氮含量上升，堿解氮含量越高，木霉菌生長速度越快，消耗堿解氮速度越快，有機質的含量就會增加。

速效磷是土壤中可以被直接被利用的磷元素。長枝木霉中的速效磷含量隨著時間的增加呈現升高的趨勢。但是，哈茨木霉中的速效磷隨著時間的增加呈現先升高，后平穩的狀態。

速效鉀是土壤中可以被植物與微生物直接利用的鉀元素，與微生物生長息息相關。隨著速效鉀含量的減少，木霉菌在生長。速效鉀含量高，使得木霉菌生長速度快，消耗速效鉀速度快。所以速效鉀有利于木霉菌的定殖。

3 結論與討論

3.1 結論

3.1.1 長枝木霉SMF2生長繁殖最快

哈茨木霉T39和長枝木霉SMF2在兩種土壤樣本中的菌絲生長狀況和產孢量差距很大。木霉的菌絲生長速率、產孢量在月季土壤明顯高于CK，月季花卉使用的有機肥較多，在加上月季的根系分泌物的作用，使木霉菌生長繁殖效果最好。

結合測定土壤樣本的指標來看，木霉菌的菌絲生長速率和產孢量與土壤氮磷鉀以及有機質的含量密切相關。其次，除了培養72 h外，哈茨木霉T39與長枝木霉SMF2相比，長枝木霉SMF2的菌絲生長速率均要稍高于哈茨木霉T39。

3.1.2月季土壤樣本中不同營養條件對木霉菌定殖的作用

不同的土壤營養條件對木霉菌定殖的影響不同。土壤樣本中土壤的有機質、堿解氮、速效鉀的含量高，綜合起來看這就是兩種木霉菌在月季土壤中菌絲生長速率和產孢量高的原因。

3.1.3 木霉菌定殖能力與土壤處理有密切的關系

土壤處理對木霉菌絲生長和產孢的影響不同。氮磷鉀含量的變化對木霉菌絲生長略有影響但對產孢的影響不明顯。

堿解氮是土壤中可以被植物與微生物直接利用的氮元素，所以培養基中會出現堿解氮含量下降的情況。但是，隨著堿解氮含量的減少，木霉菌在生長。隨著時間的增加，木霉菌的數量在不斷增加。由于木霉菌自身的活動增加了堿解氮的含量，使得堿解氮含量上升，堿解氮含量越高，木霉菌生長速度越快，消耗堿解氮速度越快，所以在木霉菌定殖過程中，增施氮肥，有利于木霉菌的定殖。

3.1.4 處理天數對木霉菌定殖能力的影響

真菌的生長繁殖也需要充足的有機質。本試驗中木霉菌分別在第3天、5天、7天、9天、11天處理了土壤樣本，均得出了隨著處理天數的增加，土壤中的有機質逐漸減少的結論。此外，對于不同木霉菌對有機質的消耗而言，在月季土壤中長枝木霉SMF2高于哈茨木霉T39，說明在木霉菌定殖的過程中需要不斷消耗土壤中的有機質，有機質的含量多少直接影響了木霉菌的定殖能力。

3.2 討論

木霉菌在土壤環境的改良、土壤肥力的提高方面越來越受到國內外專家的重視，木霉菌尤其在影響土壤理化性質方面表現突出。孫冬梅等[8]研究發現黃綠木霉處理土壤后，土壤的養分含量相比未處理的時候有所增加，改善了土壤理化性質，增加了根際微生物的數量。在施用木霉菌制劑的土壤中，土壤的全氮含量、碳氮比均比用化肥處理的土壤中高，且木霉菌的濃度越高處理的效果越明顯。

土壤的肥力由理化性質、土壤的酶活性、微生物的數量等因素共同決定，研究表明，木霉菌處理后的土壤里細菌和放線菌的數量也有所增加，某些放線菌具有固氮的作用，從而使土壤中的氮素不斷增加，有利于滿足作物對氮素的需求[9]。施肥是農作物生產中的必要措施，氮磷鉀肥是作物生長中不可缺少的肥料，合理施肥有利于作物生長，也有利于作物根際包括生防菌在內的有益微生物生長。

試驗結果證實，木霉生防菌受肥料種類及其劑量的影響，酸性肥料和適當的氮磷鉀肥配比有利于木霉菌絲生長和產孢，并有可能有利于木霉菌的根際定殖。

3.3 展望

木霉菌因在土壤微生物防治、抗生素的科學研究以及生物酶等諸多方面的應用有著十分重要的經濟價值和社會價值，近年來受到廣泛的社會關注。木霉菌生防制劑可以增強植物的抗逆性，促進對土壤養分的有效吸收利用，加速對土壤中一些有害物質的有效分解。并且木霉菌植株生長的速度快，可大規模生產，對土壤環境也無任何污染。目前木霉菌生防制劑得到了推廣和綜合利用，木霉菌生防制劑既可以有效防止土傳病害又可以有效改善植株根際的微環境，有利于其他有益菌的生長繁殖[10]。木霉菌的生防制劑與生物肥料具有投資少、產量高、綠色無公害三重優點，是未來藥劑和肥料發展的重要方向。