兩種不同提取方式下荔枝草提取物中三種有效成分含量的對比

杜曉映

(濰坊理工學院，山東 青州 262500)

荔枝草(Salvia plebeian R.Br.)是唇形科鼠尾草屬草本植物，也稱為青蛙草、蛤蟆草、皺皮草、雪見草等。荔枝草味苦性寒涼，具有諸多功效，如清熱解毒、利尿消炎、止血涼血等[1]。故可用于治療呼吸道炎癥、扁桃體炎、腎炎水腫、便血等疾病，外用可治療某些婦科疾病[2]。荔枝草在我國分布廣泛，主產于我國江蘇、安徽、福建、山東、河南等地，資源豐富，是一種很有前景的藥用植物。

我國民間廣泛運用荔枝草的功效治療疾病，隨著技術的進步，科研人員從荔枝草的藥理作用出發不斷探究其中的化學成分。研究表明，荔枝草中主要含有黃酮類、萜類、酚酸類、揮發油、植物甾醇類等多種化合物[3,4]，其中，黃酮類化合物具有抗氧化、預防心血管疾病、抗老化等功效，是眾多中藥的有效成分[5]。高車前苷是荔枝草中富含的一種主要的黃酮類化合物，藥理研究表明，高車前苷具有止咳平喘、抑菌、祛痰及保肝、抗組胺等作用[6]。齊墩果酸是萜類化合物的一種，也是荔枝草功能性成分之一，具有保肝、解毒功能，目前齊墩果酸已經成為臨床上治療急性和慢性肝炎的藥物之一[7-9]。除此之外，齊墩果酸還具有降糖，降血脂，抗炎，抗細菌、病毒和原蟲，抗氧化，抗突變，抗心腦血管疾病，促進創傷恢復，抗腫瘤，增強免疫調節等多種功能。本研究通過對水提和醇提2種提取方法下獲得的荔枝草浸膏中總黃酮、高車前苷、齊墩果酸含量的測定與比較，為荔枝草產品的進一步開發應用提供參考。

1 材料

主要儀器：Agilent 1260型高效液相色譜儀；RE52CS-1旋轉蒸發器；UV5200紫外可見分光光度計；HH-4數顯恒溫水浴鍋。

實驗樣品購于當地藥房，來源于河南，為荔枝草干草全株。

2 方法與結果

2.1 荔枝草浸膏的提取

荔枝草的干燥全草，除去黃葉、雜質，研碎成粗粉，以水或70%乙醇為溶劑，通過浸泡、加熱回流、抽濾、50℃減壓蒸餾得到浸膏。以浸膏得率為標準，優選實驗方案，其中，水提法浸泡時間1h，回流時間1h，料液比1∶15；醇提法乙醇濃度70%，料液比1∶20，回流時間2h。

2.2 浸膏中總黃酮含量的測定

將醇提浸膏和水提浸膏干燥后各取1g，置于100mL小燒杯中，加70%乙醇進行溶解，過濾后轉移至100mL容量瓶中定容，混勻后得黃酮提取液，待用。

2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

電子天平精確稱取蘆丁標準品5mg，用70%乙醇溶解至小燒杯中，于25mL容量瓶中定容，搖勻，得到標準品溶液濃度為0.2mg·mL-1。移液槍準確吸取標準溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分別置于7個已編號的10mL容量瓶中。先分別向上述7個容量瓶內加入5% NaNO20.4mL，搖勻，避光靜置6min；后加入10%A1(NO3)30.4mL，搖勻，避光放置6min；最后加入5%NaOH 4.0mL，再加水定容，搖勻，避光放置15min。將上述溶液加到玻璃比色皿的2/3處，用70%乙醇作參比溶液，在510nm波長下依次測定吸光值后，根據數據繪制標準曲線并求出標準曲線方程和擬合參數[10]。

準確吸取上述提取液A、B、C各1.00mL于10mL容量瓶中，并按上述步驟依次加入5%NaNO2、10%A1(NO3)3、5%NaOH，再以70%乙醇作參比溶液，用比色皿在510nm波長處測定吸光度，用繪制出的標準曲線即可計算出總黃酮含量。

以不同濃度的標準品為橫坐標，以紫外分光光度計搭配玻璃比色皿測定溶液在510nm處的吸光度值，測量多次后取平均值為縱坐標，進行作圖，得到圖1所示蘆丁標準曲線。

圖1 蘆丁標準曲線

以最小二乘法做線性回歸，得方程為y=11.075x-0.0275，R2=0.9841，其中，y為吸光度值(A)；x為標準品濃度(mg·mL-1)；R2為擬合參數，0

2.2.2 樣品中總黃酮的測定結果

按照標準曲線的方法測定水提法和醇提法的提取物中總黃酮含量，水提法中提取物總黃酮含量為15.6mg·g-1，醇提法中提取物總黃酮含量為16.3mg·g-1，醇提法要高于水提法。在此基礎上，若加大乙醇回流時間至3h，醇提浸膏中黃酮得率可達到2.73%，換算成荔枝草干草中黃酮含量為1.5mg·g-1。

2.3 浸膏中齊墩果酸含量的測定

浸膏干燥后稱取5g溶解于20mL去離子水中，溶解液倒入分液漏斗中，加入適量水飽和的正丁醇在通風櫥中分3次進行萃取，收集萃取液，再用旋轉蒸發儀除去正丁醇至無醇味為止，將圓底燒瓶內蒸發剩余物用甲醇溶解，并定容于50mL容量瓶中[11-14]。用紫外分光光度計進行測定其吸光度，測3次取平均值(若數值偏大，稀釋后再測定，使數值處于線性范圍內)。

2.3.1 齊墩果酸標準曲線繪制

準確稱量齊墩果酸標準品(CAS：508-02-1；分子式：C30H48O3)10.0mg，用甲醇進行充分溶解，再定容至50mL，搖勻后即得標準品溶液，其濃度為0.2mg·mL-1[15]。用移液槍精密吸取標準品溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、7mL，再用甲醇定容于10mL容量瓶中，即得0.01mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.03mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1、0.14mg·mL-1的標準品溶液。用紫外分光光度計在258nm波長下測定其分光光度值，繪制齊墩果酸在258nm下的標準曲線及回歸線方程[15,16]。

采用紫外分光光度法測定齊墩果酸標準品配制的密度梯度溶液，測得標準曲線方程為y=0.0047x-0.0258，R2=0.9946。結果表明，齊墩果酸在10～140mg·g-1范圍內具有良好的線性關系。

圖2 紫外分光光度法測齊墩果酸標準曲線

2.3.2 樣品中齊墩果酸的測定結果

按照標準曲線的方法測定水提法和醇提法的提取物中齊墩果酸含量。其中，醇提法測得齊墩果酸含量為0.187mg·g-1，水提法測得齊墩果酸含量為0.104mg·g-1，醇提法大于水提法。在此基礎上，若提前浸泡1h并加大乙醇回流時間至3h，齊墩果酸含量可達0.245mg·g-1。折合到干草中齊墩果酸含量為0.093mg·g-1。

2.4 浸膏中高車前苷含量的測定

2.4.1 對照品溶液的配制

精密稱取對照品6mg，置于10mL的量瓶中，用流動相(52%甲醇)定容至刻度，得濃度為604mg·L-1的高車前苷儲備液。再吸取上述儲備液2mL加流動相定容至10mL，即得高車前苷標準品溶液。

2.4.2 供試品溶液的配制

不同提取方式荔枝草提取物的制備：將醇提浸膏和水提浸膏干燥后分別稀釋至濃度為0.8g·mL-1，高速離心后上清液通過D101大孔樹脂柱，用10倍柱體積70%的無水乙醇通過大孔樹脂，收集70%無水乙醇部分，回收乙醇后，水浴蒸至近干，減壓干燥，研缽研細，過80目篩即得樣品。

精密稱取荔枝草提取物樣品10mg，加流動相(50%甲醇)，超聲溶解，定容至10mL，搖勻。

2.4.3 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm),流動相色譜甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(v/v，52∶50)，柱溫35℃，流速1mL·min-1，檢測波長335nm[6]。按上述色譜條件對對照品和供試品分別測定，結果塔板數>5000，分離度R>1.5，對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖3、圖4。

注：濃度604mg·L-1，進樣10μL，波長335nm。

注：進樣10μL，波長335nm。

以進樣量對峰面積進行線性回歸，得回歸方程y=1027.5x-7.1324(R2=0.9995)，結果表明,高車前苷在0.20～2.01μg范圍內線性關系良好。對色譜條件進行精密度、穩定性、重復性及加樣回收試驗，表現良好。

2.4.4 不同提取方式的樣品中高車前苷的含量測定

取水提法和醇提法樣品各4批，進樣10μL，HPLC測定，用標準曲線法計算，4批樣品中高車前苷含量測定結果見表1。其中，水提法樣品中高車前苷平均含量為0.498mg·g-1，醇提法樣品中高車前苷平均含量為1.018mg·g-1。

表1 不同提取方式下1g荔枝草提取物樣品中高車前苷的含量測定

3 討論

3.1 浸膏的提取

在藥用植物的開發利用中，往往需要先將植物的有效成分提取制成浸膏，再加工成產品，在浸膏的提取中，浸膏得率受多種因素的影響，本試驗所用的水提法是以浸泡時間、料液比、回流時間為主要影響因素，醇提法是以乙醇濃度、料液比、回流時間為主要影響因素，分別作三因素三水平正交實驗后，以浸膏得率為測定指標，優選的浸膏提取方案。

其中，水提法采用浸泡時間1h，料液比1∶15，回流時間1h。醇提法采用乙醇濃度70%，料液比1∶20，回流時間2h。在2種方法中水提法浸膏得率要略高于醇提法。

3.2 不同提取物3種成分的含量比較

經過反復試驗發現，70%醇提下總黃酮、齊墩果酸、高車前苷的含量都遠遠高于水提樣品中3種物質的含量。

本試驗先以浸膏提取率為標準優選了水提法和醇提法中浸膏得率最高的2種方案，再對2種浸膏中總黃酮、齊墩果酸和高車前苷進行了測定與比較，需要注意的是，在浸膏的提取中，浸膏得率最大的方案并不是其有效成分最高的方案。如果加大浸泡時間或回流時間，可以進一步提高其有效成分的含量。該方法標準統一，因此測定結果相對可靠，對荔枝草富含的其他藥用植物有效成分的進一步測定和荔枝草產品的進一步開發應用都具有一定的指導意義。