生物信息學分析與分子對接紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎分析

朱 潔 王青華 趙丹丹

·論 著·

生物信息學分析與分子對接紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎分析

朱 潔 王青華 趙丹丹

浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院藥劑科，浙江湖州 313000

探討紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結型慢性盆腔炎的作用機制。通過自研Python腳本在TCMSP數據庫中篩選紫英抗炎合劑的活性成分和靶基因，并通過人類基因數據庫GeneCards獲得濕熱瘀結型慢性盆腔炎的靶基因，使用CytoScape3.9.0構建“藥物-成分-靶點”、“成分-通路”網絡。將篩選到的關鍵靶基因導入STRING在線平臺，建立蛋白與蛋白相互作用網絡，并進行生物信息分析以研究其機制。最后通過AutoDockTools和AutoDock vina進行分子對接分析，并與醫院現有的西藥的結合度進行對比后應用PyMol可視化作圖。①從紫英抗炎合劑中篩選出豆甾醇等59個中藥有效活性成分，白細胞介素6、腫瘤壞死因子等72個關鍵基因；②生物信息分析結果顯示，紫英抗炎合劑生物學過程和功能集中在調節炎癥反應、細胞因子活性等；③生物信息分析信號通路顯示，紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎主要涉及PI3K-Akt信號通路、NF-kB信號通路等；④分子對接結果顯示紫英抗炎合劑中的重要活性成分與慢性盆腔炎的核心靶點結合較好，甚至優于阿奇霉素和頭孢西丁，篩選出結合度好、有氫鍵形成的構象關系IL6-Stigmasterol進行可視化處理。以上研究為紫英抗炎合劑日后進一步探索提供了新思路，也為通過網絡藥理學、生物信息分析和分子對接的方法，發展醫院的新制劑提供了新的研究途徑。

濕熱瘀結型慢性盆腔炎；中藥復方；紫英抗炎合劑；生物信息分析；分子對接

盆腔炎是婦科常見的生殖系統疾病[1]，慢性盆腔炎患者常見癥狀有下腹部脹墜、腰骶部酸痛[2]。中醫學理論認為，盆腔炎是由于正氣虧損、濕熱之邪內侵，化毒蓄積下焦而致氣血瘀滯引起，瘀濕過甚而化為熱，致病情纏綿不愈，中醫辨證可將其分為氣滯血瘀、濕熱瘀阻等多種分型[3-5]。

紫英抗炎合劑為浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院已故省名老中醫朱承漢經驗方，方中敗醬草、紫花地丁等藥均可起到清熱解毒的效果，同時紫花地丁、乳香活血消腫，蒲公英散結，延胡索行氣、止痛，多藥共用奏清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛的功效，適用于濕熱瘀結型盆腔炎。浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院多年的臨床應用和對照研究也證明，紫英抗炎合劑在治療濕熱瘀結型慢性盆腔炎方面具有顯著的療效[6-9]。

隨著大數據、網絡藥理學、生物信息分析、分子對接技術的發展，對藥物的研究尤其是針對中藥復方中存在的多成分、多靶點的研究有了新的探索方法。網絡藥理學、生物信息分析使用的數據庫持續更新，分析精準；使用分子對接工具進行分子虛擬對接運算速度快，應用精度高，可以為中藥復方成分的研究提供有力的參考依據。

本研究通過網絡藥理學結合生物信息分析，構建藥物、成分、靶點、通路之間的關系網絡，探討紫英抗炎合劑的藥物活性成分、潛在靶點、作用機制和相關信號通路，闡述紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結型慢性盆腔炎的作用機制。通過分子對接技術，并增加西藥對照組進行對接，選取結合能高、有氫鍵形成并有較穩定構象的對接結果，在證實紫英抗炎合劑治療疾病的優勢方面具有指導意義，同時為治療開辟新的思路。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件

①TCMSP中藥系統藥理學數據庫與分析平臺：https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php；②中國科學院上海有機化學研究所，化學專業數據庫：http://www. organchem.csdb.cn.[1978-2021]；③蛋白質數據庫UniProt：http://www.uniprot. org/uploadlists/；④人類基因數據庫GeneCards：https://www.genecards.org；⑤STRINGVersion 11.5：https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=bBrtGEVz6u1L&input_page_show_search=off；⑥Metascape平臺：https://metascape.org/gp/index.html；⑦微生信平臺：http://www.bioinformatics.com.cn/；⑧PubChem數據庫：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/；⑨CTD比較毒理基因組學數據庫：http://ctdbase.org/；⑩RCSB PDB蛋白數據庫：https:// www.rcsb.org/；?DrugBank數據庫：https://go.drugbank. com/；?CytoScape 3.9.0；?AutoDockTools 1.5.7；?PyMol；?AutoDock vina1.2.3，Draw Venn Diagram：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/.

1.2 方法

1.2.1 篩選紫英抗炎合劑有效活性成分及相關靶基因 通過自研Python腳本設置TCMSP參數“Ingredients”“Related Targets”、口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，批量輸入關鍵詞，自動篩選紫英抗炎合劑各藥物活性成分及對應的靶基因數據。同時通過中國科學院上海有機化學研究所、化學專業數據庫查找TCMSP中沒有的藥物，獲取化學成分，并選擇相同篩選條件，獲取對應的靶基因數據，最后通過蛋白質數據庫UniProt對數據進行校正。

1.2.2 獲取慢性盆腔炎相關基因 在人類基因數據庫GeneCards中以“Chronic pelvic inflammatory disease”搜索慢性盆腔炎相關基因。根據《中藥新藥臨床研究指導原則》對于濕熱瘀結型慢性盆腔炎的癥狀描述內容，以下腹痛、白帶多、色黃質稠、腰骶痛、舌有瘀斑、苔膩、脈弦等繼續搜索，得到的基因經過合并去重后，與之前得到的慢性盆腔炎基因一同錄入Draw Venn Diagram網站，交集數據即研究所需濕熱瘀結型慢性盆腔炎基因[10]。

1.2.3 紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎作用靶點篩選 將“敗醬草”“蒲公英”“大血藤”“紫花地丁”“乳香”“延胡索”的藥物靶點合并去重，與慢性盆腔炎的疾病靶點共同錄入Draw Venn Diagram網站，繪制韋恩圖后顯示的兩者交集即為紫英抗炎合劑潛在治療靶點。

1.2.4 構建蛋白-蛋白相互作用網絡 STRING平臺中導入篩選出的紫英抗炎合劑靶點，構建蛋白相互作用網絡。參數設置選項為“multiple proteins（多種蛋白質）”，蛋白種類為“homo sapiens”，相互作用閾值設定為高置信度“highconfidence>0.9”，隱藏游離蛋白，其他均默認，生成的PPI文件下載后導入CytoScape軟件繪制成圖。運用Cytoscape中“CytoHubba”插件中的多種算法結合“MCODE”插件篩選核心靶點，取交集基因，根據CTD數據庫中疾病靶基因的inference score排名情況，綜合考量后獲得最終的核心靶點。

1.2.5 藥物-成分-靶點網絡構建 對比紫英抗炎合劑中成分靶點及慢性盆腔炎（濕熱瘀結型）靶點，找出各項成分對應的靶點，整理文件數據并導入CytoScape軟件構建網絡圖，即“藥物-成分-靶點”網絡。在網絡中各項節點代表藥物、靶點及化學成分，邊代表每個節點之間相互的作用。

1.2.6 紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎的靶點功能與通路的富集分析 Metascape平臺功能包括PPI網絡結構、生物通路富集分析及基因注釋。將潛在治療靶點錄入Metascape平臺，選擇物種種類為“homo sapiens”，設置<0.01，最小計數為3，富集因子值超過1.5，對生物學過程和代謝通路進行分析，同時將KEGG與GO數據結果保存后上傳至微生信平臺，并進行可視化構圖。

1.2.7 重要活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證 將藥物活性成分網絡按度值排序，選擇前5的成分從PubChem數據庫搜索對應配體的結構。將與濕熱瘀結型慢性盆腔炎相關的核心靶點作為對接的受體。在UniProt數據庫中查找人類已驗證的靶點受體蛋白ID，進入RCSB PDB蛋白數據庫，選擇分辨率最高的人源結構做為對應的蛋白受體結構；將受體蛋白文件導入PyMOL軟件進行去除溶劑、改性殘基等操作，然后利用AutoDockTools加氫、計算電荷，轉換格式保存。通過AutoDockTools的Grid Box對活性口袋參數進行確定，使用vina分子對接，并應用“Analyze”中“Show Interations”查看氫鍵，最后選擇結合能高、構象較好的結果導入Pymol進行可視化作圖[11]。

在DrugBank數據庫中搜索關鍵詞“Chronic pelvic inflammatory disease”，獲得用于治療慢性盆腔炎的西藥藥物，并選取浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院現有的品種從PubChem數據庫獲取對應的結構做為對照配體，與核心靶蛋白受體進行分子對接，并比較對接結果。

2 結果

2.1 紫英抗炎合劑有效活性成分和靶基因

TCMSP中篩選發現，“紫花地丁”沒有相應結果，不能進行后續研究；通過中國科學院上海有機化學研究所化學專業數據庫查找“蒲公英”獲取化學成分，并在TCMSP中以OB≥30%和DL≥0.18為條件，篩選有效活性成分及對應的靶基因數據。

蛋白質數據庫UniProt進行校正后得到敗醬草、大血藤、蒲公英、乳香及延胡索靶基因分別有209個、46個、28個、12個、208個，合并去重后共得到中藥靶基因237個。

2.2 濕熱瘀結型慢性盆腔炎相關基因

在GeneCards數據庫檢索“Chronic pelvic inflammatory disease”，并通過中位數卡值、去重后共篩選出1936個慢性盆腔炎相關基因。檢索下腹痛、白帶多、色黃質稠、腰骶痛、舌有瘀斑、苔膩、脈弦為關鍵詞搜索，合并去重后得到646個濕熱瘀結型相關的基因，與慢性盆腔炎基因錄入Draw Venn Diagram，得到兩者交集并導出數據，即濕熱瘀結型慢性盆腔炎基因共434個。

2.3 疾病—成分靶點

將紫英抗炎合劑各成分對應的靶點組內去重后，和疾病基因共同導入Draw Venn Diagram網站，繪制韋恩圖，所得72個靶點即紫英抗炎合劑作用于濕熱瘀結型慢性盆腔炎的潛在靶點，見圖1。

圖1 紫英抗炎合劑-濕熱瘀結型慢性盆腔炎靶點韋恩圖

2.4 PPI網絡構建

將前述72個關鍵靶基因輸入STRING，按照1.2.4進行參數設置，下載PPI.tsv文件后導入Cytoscape軟件繪制PPI網絡圖，圖中八邊形節點代表靶點，靶點越大越深代表其在網絡中涉及的生物功能越多，越重要，見圖2。

運用Cytoscape中“CytoHubba”插件中的多種算法結合“MCODE”插件篩選核心靶點，取交集基因，見圖3。結合CTD數據庫中疾病靶基因的檢索結果，根據inference score排名情況綜合考量后獲得最終的核心靶點為IL6、TNF。

2.5 藥物-成分-靶點網絡構建

將紫英抗炎合劑的5個藥物、59種有效活性成分及72個關鍵靶點按要求整理成Network和Type文件后導入Cytoscape，構建“藥物-成分-靶點”網絡結構，見圖4。

圖2 蛋白質互作網絡關系圖

注：八邊形代表靶點，顏色由深至淺、大小由大到小代表重要程度降低

圖3 核心靶基因

圖4 紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎藥物-化學成分-靶點網絡圖

注：六邊形代表藥物，三角形代表化學成分，菱形代表靶點

該網絡圖包括136個節點，423條邊，其中邊代表相互關系，使用“Analyze Network”計算“degree”值，degree前5數據結果提示，“degree”值排名前5的化學成分為MOL000098槲皮素、MOL000006木犀草素、MOL000422山奈酚、MOL000449豆甾醇、MOL000358β-谷甾醇，此5種成分為紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結型慢性盆腔炎的主要成分。圖中一個藥物包含了多種成分，一種成分對應多個靶點，一個靶點又和不同的成分相對應，充分驗證了紫英抗炎合劑做為一種中藥復方制劑治療慢性盆腔炎是通過多成分、多靶點協同作用進行。

2.6 Go功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.6.1 Go功能富集分析 通過將2.3中獲取的靶點錄入Metascape平臺，選擇物種種類為“homo sapiens”，設置<0.01，最小計數為3，富集因子>1.5，分析其主要的生物學過程與功能，共富集出1300個生物學過程（BP）、47個細胞成分（CC）、89個分子功能（MF），根據校正后值進行排序，BP、CC、MF三項各自選擇前20、16、20個導入微生信進行柱狀圖展示，見圖5。

紫英抗炎合劑主要參與的生物過程包括對細胞遷移的積極調節、細胞分化的負調節、調節上皮細胞增殖、調節平滑肌細胞增殖、對生長因子的反應、調節炎癥、對細胞外刺激的反應等。

分子功能主要富集在細胞因子活性、DNA結合轉錄因子結合、生長因子結合、趨化因子受體結合、腫瘤壞死因子受體結合、磷酸蛋白結合、酶抑制劑活性等。

2.6.2 KEGG通路富集分析 通過將2.3中所得靶點錄入Metascape平臺，選擇物種種類為“homo sapiens”，設置<0.01，最小計數為3，富集因子>1.5，分析其主要的信號通路，共獲取143條通路，結合值對通路排序，選擇排名前20的通路導入微生信進行氣泡圖展示，見圖6。

圖5 GO富集BP、CC、MF三合一柱形圖

注：柱形高度由高到低代表涉及功能重要性依次降低

圖6 KEGG通路氣泡圖

注：氣泡由大到小、顏色由深到淺代表參與通路數量依次降低

紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎參與的信號通路包括癌癥通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB、甲狀腺激素、VEGF、趨化因子信號通路、Th17細胞分化、細胞凋亡等。

將排名前20的通路和其作用相關的63個關鍵靶點導入CytoScape構建“通路-靶點”網絡結構，見圖7。

2.7 重要活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證

將篩選出的成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇作為配體，從PubChem數據庫獲取對應配體的結構。將2.4中獲得的核心靶點蛋白IL6、TNF按1.2.7中所示方法選擇分辨率最高的人源結構1ALU、5UUI做為對應的蛋白受體結構。應用AutoDockTools確定Grid Box獲得活性口袋參數后，使用vina進行分子對接操作得到每種活性成分配體和受體蛋白之間的結合能，見表1。

圖7 靶點-通路網絡關系圖

注：圖中圓形代表通路，六邊形代表靶點

配體和受體對接結合能越低表示分子間結合的越穩固，結合能≤-5.0kcal/mol時表示兩者結合的較好，結合能≤-7.5kcal/mol時表示兩者間結合的非常好[11,12]。紫英抗炎合劑中活性成分與關鍵靶點的各組對接結果均<-5.0kcal/mol，表明結合活性良好，紫英抗炎合劑的主要活性成分對慢性盆腔炎的核心靶點具有較強的關聯性。使用“Analyze”中“Show Interations”查看氫鍵，最后選擇結合能高、構象較好的結果Stigmasterol-IL6進行可視化處理，分子對接圖和結合位點，見圖8。

表1 紫英抗炎合劑重要活性成分與核心靶點對接結合能

圖8 豆甾醇-IL6分子對接圖

選取浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院現有治療慢性盆腔炎的品種Azithromycin、Cefoxitin，從PubChem數據庫獲取對應的結構，做為對照配體，和核心靶蛋白受體進行分子對接，見表2。紫英抗炎合劑中的幾組結合能均低于對照的西藥結合能，紫英抗炎合劑的主要活性成分對慢性盆腔炎的核心靶點的關聯性可能優于西藥。

表2 對照西藥活性成分與核心靶點對接結合能

3 討論

本研究應用網絡藥理學和生物信息分析的方法，分析了紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎時疾病-藥物-成分-靶點之間的相關信息，進行梳理后構建關系網絡，直觀顯示該復方制劑中各有效成分、制劑的核心成分和疾病靶點的互相作用，也展示了生物功能和信號通路之間等各種復雜的分子網絡關系。

研究人員共篩選出活性成分59個，與疾病的交集靶點72個，GO富集出1300個生物學過程，89個分子功能，得到143條信號通路，驗證了紫英抗炎合劑是由多種成分相互協同作用，對疾病通過多通路、多靶點進行調控和治療。

通過研究發現，紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎的主要靶點作用于槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇上，分子對接結果顯示以豆甾醇尤其突出，而豆甾醇同時存在于敗醬草、蒲公英、延胡索中。多篇文獻研究結果顯示敗醬草中發現的槲皮素、木犀草素、山奈酚均具有抗炎、抗病毒的生物活性[13-15]。同時有多項研究證實，木犀草素可以通過NF-kB等多個信號通路發揮其藥理作用，有效改善IL6的生成[16-20]。β-谷甾醇、豆甾醇作為甾醇類化合物，具有抗腫瘤、抗炎的作用[21]。

總結研究數據發現，紫英抗炎合劑的關鍵靶點有TNF、IL6等。IL6、TNF被視為促炎因子，能刺激炎癥介質的釋放，引起組織損傷[22]。IL6不僅能激活中性粒細胞，還能加劇炎癥介質的產生[23]。TNF是慢性盆腔炎炎癥反應中的重要影響因子，細菌感染后TNF迅速升高，逐漸演變成慢性盆腔炎[24,25]。由于傳統中藥研究思路的影響，雖然臨床已證實慢性盆腔炎是促炎和抗炎雙因子共同作用的過程，但紫英抗炎合劑仍局限于最初的臨床案例研究，后期停滯在只使用而未再挖掘的層面，致使文獻中也沒有紫英抗炎合劑對慢性盆腔炎患者血清影響的進一步深入研究。

KEGG分析發現富集程度較高的有PI3K-Akt信號通路、Th17細胞分化、NF-kB信號通路等多條與癌癥、炎癥相關的信號通路。其中TNF、IL6在以上幾條通路中均有參與，后期將通過其他實驗途徑對紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結型慢性盆腔炎的主要信號通路進行分析和驗證。

分子對接技術起源于20世紀80年代，可以從微觀水平來分析結構，從而確定藥物的生物利用度[26,27]。研究人員應用分子對接技術，將紫英抗炎合劑配體和慢性盆腔炎受體進行模擬對接，同構觀察發現每一項對接的結合能均小于-5.0kcal/mol，一定程度上能說明紫英抗炎合劑與慢性盆腔炎作用靶點受體在結合蛋白方面較好；比較中西藥組間結合能后發現，紫英抗炎合劑組結合能均低于頭孢西丁組，絕大部分低于阿奇霉素組，因此，就此3個受體而言，紫英抗炎合劑同它們的對接結合程度要優于頭孢西丁和阿奇霉素。

選擇出結合能低并且結合狀態佳的結構Stigmasterol-IL6留待做進一步的驗證研究。

綜上，紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎（濕熱瘀結型）的靶點主要以消除炎癥為主，即IL6與TNF。涉及的通路包括PI3K-Akt及Th17細胞分化等。其生物過程主要涉及調節炎癥、蛋白磷酸化的積極調控等。本次研究通過分子對接方法、生物信息分析并結合中藥復方網絡藥理學，從復方制劑的成分出發，由靶點到通路到對接模擬，逐步闡明了紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎是通過多成分協作、多靶點結合、多通路調控而產生作用，為后續紫英抗炎合劑的繼續研究帶來了新的角度和方向，奠定深入研究的數據基礎，也為醫院未來新制劑的開發提供了新的方法和路徑。

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Analysis of bioinformatics and molecular docking Ziying anti-inflammatory mixture in the treatment of chronic pelvic inflammatory disease

Department of Pharmacy, Huzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, University of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang, Huzhou 313000, China

To explore the mechanism of Ziying anti-inflammatory mixture in the treatment of damp-heat stasis chronic pelvic inflammatory disease.The active components and target genes of Ziying anti- inflammatory mixture were screened in TCMSP database by self-developed Python script, and the target genes of chronic pelvic inflammatory disease of damp-heat stasis type were obtained from the human gene database GeneCards. “Component-target” and “Component-pathway” networks. The screened key target genes were imported into the STRING online platform, a protein-protein interaction network was established, and bioinformatics analysis was performed to study its mechanism. Finally, the molecular docking analysis was carried out by AutoDockTools and AutoDock vina, and the binding degree of the existing western medicine in the hospital was compared with PyMol for visualization.A total of 59 active ingredients of traditional Chinese medicine such as stigmasterol, 72 key genes such as interleukin-6 and tumor necrosis factor were screened out from Ziying anti-inflammatory mixture; The functions focus on regulating inflammatory response, cytokine activity, etc.; Bioinformatics analysis of signaling pathways showed that the treatment of chronic pelvic inflammatory disease with Ziying anti-inflammatory mixture mainly involves PI3K-Akt signaling pathway, NF-kappa B signaling pathway, etc.; The important active components in Ziying anti-inflammatory mixture bind well to the core targets of chronic pelvic inflammatory disease, even better than azithromycin and cefoxitin. The conformational relationship IL6-Stigmasterol with good binding degree and hydrogen bond formation was screened out for visualization.The above research provides new ideas for further exploration of the preparation, and also provides a new research approach for the development of new preparations in hospitals through network pharmacology, bioinformatics analysis and molecular docking methods.

Chronic pelvic inflammatory disease of damp-heat stasis type; Traditional Chinese medicine compound; Ziying anti-inflammatory mixture; Bioinformatics analysis; Molecular docking

R285

A

1673-9701(2022)36-0006-08

朱潔，電子信箱：ZJ13819231548@163.com

（2022–07–04）

（2022–09–06）