轉錄組和蛋白組分析海帶褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7細胞的免疫調節作用

崔美玉, 耿麗華, 張全斌

轉錄組和蛋白組分析海帶褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7細胞的免疫調節作用

崔美玉1, 2, 3, 耿麗華1, 2, 張全斌1, 2

(1. 中國科學院海洋研究所, 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室, 海洋生物與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

海帶()是我國的主要經濟褐藻, 從海帶中制備的褐藻多糖硫酸酯具有免疫調節等多種生物活性, 但鮮有基于組學的研究報道。本文采用RNA高通量測序(RNA-sequencing, RNA-seq)轉錄組學技術以及平行反應監測(Parallel Reaction Monitoring, PRM)靶向定量蛋白組學方法, 探究海帶褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬細胞RAW 264.7后對巨噬細胞功能和通路的影響。結果表明, 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)作用于RAW 264.7細胞后, 差異表達基因主要富集在免疫反應、先天性免疫應答等生物過程以及TNF、NF-κB、Toll樣受體等信號通路, 也可促進RAW 264.7細胞膜蛋白A類清道夫受體(SR-A)中SCARA3和Toll樣受體中TLR4的表達。采用流式細胞儀對褐藻多糖硫酸酯作用后SR-A和TLR4的表達量進行蛋白水平的驗證, SR-A和TLR4的表達量均有升高, 證實了組學結果的可靠性。本研究結果為利用褐藻多糖硫酸酯開發具有免疫調節作用的功能食品或藥物提供依據。

褐藻多糖硫酸酯; 巨噬細胞; 免疫調節; 轉錄組; 蛋白組

免疫系統是機體進行免疫應答和發揮免疫功能的重要系統, 可以發現并有效阻止病原體入侵清除病原微生物。巨噬細胞作為一種先天性免疫細胞, 在免疫系統中發揮著重要作用[1], 在非特異性免疫中, 巨噬細胞通過吞噬作用直接清除病原體等有害物質并介導炎癥反應; 在特異性免疫中, 巨噬細胞作為抗原呈遞細胞, 識別病原體相關分子模式, 將抗原性異物呈遞給T細胞或B細胞, 激活機體的免疫應答。巨噬細胞功能的發揮與其表面模式識別受體密不可分, 其中, Toll樣受體和清道夫受體是廣泛存在于巨噬細胞表面的宿主防御系統的關鍵模式識別受體, 對先天性免疫系統識別病原體至關重要, 并介導免疫調節反應[2-3]。

海帶作為一種大型經濟藻類, 含有豐富的營養物質。從海帶中制備的褐藻多糖硫酸酯(fucoidan, FPS)是海洋褐藻特有的一類含有巖藻糖的硫酸化多糖, 主要由巖藻糖和半乳糖組成, 也含有一定量的甘露糖、木糖等其他單糖[4]。研究表明褐藻多糖硫酸酯具有多種生物活性, 包括抗炎[5]、免疫刺激[6]、抗氧化[4]和抗凝血[7]以及神經保護等活性[8]。褐藻多糖硫酸酯可激活巨噬細胞, 提高巨噬細胞中一氧化氮(nitric oxide, NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, iNOS)的表達, 以及白介素-6(Inter-leu-kin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)等細胞因子的生成[9-11]。而且, 褐藻多糖硫酸酯促進NO和iNOS的表達, 引起的免疫調節反應, 可能是通過清道夫受體介導的[11]。同時, 也有研究表明褐藻多糖硫酸酯也能通過激活TLR4, 顯著增強RAW 264.7細胞的活性, 誘導NO、IL-6和TNF-α的表達[10]。

轉錄組學是在某一生理條件下, 細胞內所有細胞轉錄產物的總和。檢測在轉錄組中基因表達的上調和下調能夠特異性地說明藥物在該過程中所發揮的生物功能, 有利于探究基因變化背后的機制。轉錄組測序技術具有高通量、高準確性、高靈敏度等優勢[12], 目前在免疫學領域被廣為應用, 但欲進行精確的生物學研究, 仍需蛋白組學的支持。PRM蛋白質組學是不依賴于抗體、基于質譜的靶向蛋白精準定量技術[13], 具有高分辨和高精度的特點。基于PRM靶向定量蛋白組學, 我們可以通過選取模式識別受體特定的目標肽段直接進行相對定量檢測。

目前, 海帶來源褐藻多糖硫酸酯免疫調節活性的研究大多是從細胞和動物水平上展開的, 但由于人體是一個相對較復雜的系統, 當受到外部刺激時, 多種組織、器官以及細胞之間相互作用, 共同調節機體生理功能的變化。因此, 在本研究中采用RNA-Seq轉錄組學和PRM靶向定量蛋白質組學技術, 從整體上探究從海帶中制備的褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬細胞后, 巨噬細胞功能的變化以及具體模式識別受體的表達情況, 期望為利用海帶開發具有免疫調節作用的功能食品或藥物提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

海帶樣品來源于山東榮成, 褐藻多糖硫酸酯制備方法參照實驗室之前的方法[4], 其巖藻糖含量為29.12%, 硫酸基含量為33.01%, 糖醛酸含量為1.93%, 還含有一定量的半乳糖、甘露糖和葡萄糖等。

低密度脂蛋白(LDL)、1, 1’-雙十八酯基-3, 3, 3, 3, 四甲基-吲哚碳菁高氯酸鹽標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)、乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)、PBS緩沖液(PBS)購自北京索萊寶公司; RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司; 胎牛血清(Gibico)購自美國賽默飛公司; 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)購自上海源葉; 二甲亞砜(DMSO)、噻唑藍3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazo-lium bromide, MTT)購自美國Sigma公司; ELISA試劑盒購自武漢博士德公司; TLR4/PE(貨號: 12-9041-80)購自美國eBioscience; SR-A/PE(貨號: ab275707)購自美國Abcam。

1.2 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后細胞活力和NO、細胞因子的表達

NO表達: 將RAW 264.7細胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板, 每孔加入培養基100 μL。在細胞培養箱中培養至密度60%～80%時, 加入FPS(25, 50, 100和 200 μg/mL), 以LPS(1 μg/mL)作為陽性對照組, CON空白對照組不做任何處理, 每組設置3個復孔。繼續培養24 h后, 每孔吸取上清液50 μL, 加入至新的96孔板, 再分別各加入50 μL Griess試劑I和Griess試劑II, 搖勻后使用多功能酶標儀, 在540 nm吸光度下檢測吸光值。以NaNO2做標準曲線, 計算對照組以及處理組的NO含量。

細胞活力: 細胞加藥處理同上, 當給藥后培養24 h后, 每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。在37 ℃恒溫培養箱中繼續培養4 h后, 輕輕吸棄上清液, 加入150 μL DMSO后, 在搖床上搖晃5 min, 充分溶解結晶后, 使用多功能酶標儀, 在490 nm吸光度下檢測吸光值。把空白對照組的細胞活力定為100%, 處理組的細胞活力相對于空白對照組計算。

ELISA檢測細胞因子表達: 根據NO實驗篩選出FPS的最佳濃度進行后續實驗, 細胞加藥處理同上。給藥后繼續培養24 h, 小心收集上清液, 轉移至0.5 mL EP管中, 在4 ℃, 220′離心25 min后吸取上清液, 置于?20 ℃保存, 采用ELISA試劑盒檢測細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α。

1.3 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后細胞總RNA的提取

將RAW 264.7細胞按照1×105個/孔的密度接種于24孔板中, 當細胞密度達到60%～80%時, 加入FPS (100 μg/mL)或LPS(1 μg/mL), 同時設置空白組, 每組設置3個復孔。在37 ℃恒溫培養箱中孵育3 h后, 取出至冰上。棄掉培養基, 迅速用預冷的PBS清洗3次細胞后, 加入1 mL Trizol裂解液, 迅速用細胞刮刀輕輕將細胞刮至一側, 輕輕吹打混勻至形成清亮透明的液體, 轉移至無酶管中, 放于?80 ℃冰箱中保存待測。

1.4 轉錄組文庫的構建和測序

小鼠巨噬細胞RAW 264.7真核轉錄組文庫交由拜譜生物科技有限公司(中國, 上海)構建。采用Oligo (dT)磁珠, 從總RNA中富集帶有多聚腺苷酸(polya-denylic acid, polyA)的mRNA, 使用離子打斷方式, 將RNA打斷成長度為300 bp左右的片段。以這些mRNA片段為模板, 使用逆轉錄酶和隨機六堿基引物合成第一條cDNA鏈, 并以第一條cDNA鏈為模板合成第二條cDNA鏈, 再經PCR擴增進行文庫片段的富集, 文庫大小為450 bp。構建好的文庫采用Agilent 2100 Bioanalyzer進行質檢, 根據文庫所需數量及有效濃度, 混合含有不同Index序列的文庫, 統一稀釋為2 nmol/L, 通過堿變性后構建單鏈文庫。

構建好的文庫利用第二代測序技術(Next-Gene-ration Sequencing, NGS), 采用Illumina測序平臺, 對文庫進行雙末端測序(Paired-end, PE)。

1.5 數據組裝和基因功能注釋

為確保數據的可靠性, 過濾原始下機數據(Raw Data), 得到高質量的序列(Clean Data)。過濾的標準為: 除3′端帶接頭的序列以及去掉平均質量分數低于Q20的Reads。使用Sringtie軟件進行轉錄本組裝, 得到的Unigene文庫進行下一步分析。采用Blast軟件將Unigene序列與基因本體論聯合會建立的數據庫(Gene Ontology, GO, http://geneontology. org/)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto En-cy-clo-pedia of Genes and Genomes, KEGG, http://www. kegg.jp/)、真核生物直系同源蛋白質聚類(Evolu-tionary Genealogy of Genes: Non-supervised Ortho-logous Groups, eggNOG, http://eggnog.embl.de/ version_3.0/)、UniProt 知識庫(UniProt Knowledge-base, UniProtID, http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)、國際生物化學會酶學委員會(Enzyme Commission, EC, http://enzyme.expasy.org/)進行比對后, 得到Uni-ge-ne文庫的注釋信息。

1.6 差異表達基因及功能富集分析

使用Tophat2軟件比對參考基因組信息, 由比對結果進一步計算出每個基因的表達量, 對樣品進一步進行表達差異分析和富集分析。

基因表達差異分析須同時滿足顯著性<0.05以及表達差異倍數|log2(差異表達倍數)|>1, 即可視為差異表達基因。為描述基因的分布情況、顯著性以及基因的表達倍數差異, 使用ggplots2軟件繪制差異表達基因的火山圖。并對差異基因進行GO和KEGG富集分析, 其中GO(Gene Ontology)富集可明確其參與的主要分子功能(Molecular Function)、生物學過程(Biological Process)、和細胞組分(Cellular Component)。KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集可對基因產物在細胞中的基因產物功能及其代謝途徑進行分析。

1.7 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后細胞總蛋白的提取

將RAW 264.7細胞按照1 × 105個/孔的密度接種于24孔板中, 當細胞密度達到60%～80%時, 加入FPS(100 μg/mL)或LPS(1 μg/mL), 同時設置空白組, 每組設置3個復孔。在37 ℃恒溫培養箱中孵育3 h, 取出至冰上。棄掉原培養基, 迅速用預冷的PBS清洗3次細胞后, 加入3 mL PBS, 用細胞刮刀將細胞迅速刮取至一側, 并反復吹打混勻后, 轉移至10 mL旋蓋的離心管中, 13 800′離心3 min, 棄掉上層PBS, 將細胞沉淀迅速轉移至液氮中冷凍, 之后放于?80 ℃冰箱保存待測。

1.8 蛋白酶解及定量

取蛋白樣品加入400 μL 8 mol/L尿素, 冰浴中超聲波處理, 在4 ℃, 16 000×下離心20 min后取上清。每個樣品取200 μg, 加入二硫蘇糖醇, 使其終濃度為10 mmol/L, 在37 ℃反應1 h, 加入吲哚-3-乙酸, 終濃度為50 mmol/L, 避光條件下反應30 min。每個樣品加入胰蛋白酶(酶活1: 50), 于37 ℃反應過夜, 定量脫鹽后等量混合。

1.9 LC-PRM/MS分析

根據轉錄組學富集的主要通路以及巨噬細胞表面主要的模式識別受體, 選取目標蛋白I型A類清道夫受體(MSRE, UniProtKB: P30204)、II型A類清道夫受體(MARCO, UniProtKB: Q60754)、Ⅲ型A類清道夫受體(SCARA3, UniProtKB: Q8C850)、Ⅴ型A類清道夫受體(SCARA5, UniProtKB: Q8K299)Toll樣受體4(TLR4, UniProtKB: Q9QUK6)、Toll樣受體2(TLR2, UniProtKB: Q9QUN7)、Toll樣受體13(TLR13, UniProtKB: Q6R5N8)進行PRM靶向定量蛋白組學研究。

取適量每例樣品的肽段進行LC-PRM/MS分析, 使用Easy nLC 1 200納聲流速色譜系分離。緩沖液為A-0.1%甲酸水溶液, B-0.1%甲酸、乙腈和水混合溶液。流速為300 nL/min。肽段分離后用Q-Exactive HFX質譜儀(Thermo Scientific)進行靶向PRM質譜分析。分析時長為60 min, 正離子檢測模式, 母離子的掃描范圍為300～1 500 m/z。一級質譜分辨率為70 000 (m/z 200), AGC target為3e6, Maximum IT為200 ms。二級質譜全掃描分辨率為17 500 (m/z 200), AGC target為1e6, Maximum IT為100 ms。對得到的質譜原始下機數據, 使用軟件Skyline 4.1進行PRM數據分析。

1.10 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后SR-A和TLR4的表達

將RAW 264.7細胞按照1 × 105個/孔的密度接種于12孔板中, 當細胞密度達到60%～80%時, 每孔分別加入FPS(100 μg/mL)或LPS(1 μg/mL), 同時設置空白組, 在37 ℃恒溫培養箱中繼續培養24 h后, 棄掉上清, 用PBS清洗細胞3次, 再用500 μL PBS吹打混勻細胞, 轉移至1.5 mL的EP管中, 在100×g下離心5 min。取1×106個細胞, 用100 μL緩沖液重懸后, 加入Fc受體阻斷劑(每106個細胞2 μL), 在室溫孵育10～20 min, 離心將Fc受體阻斷劑棄掉。用PBS再清洗一遍細胞, 分別按照相應比例使用抗體孵育緩沖液配制SR-A/PE和TLR4/PE的熒光一抗(每106個細胞100 μL緩沖液), 輕輕渦旋后, 在4 ℃避光孵育1 h。用PBS清洗3次細胞, 用500 μL PBS重懸, 經篩絹過濾后, 采用BD流式細胞儀上機分析, 全程避光, 以防止熒光淬滅。

1.11 褐藻多糖硫酸酯是否與清道夫受體結合

將RAW 264.7細胞按照1×105個/孔的密度接種于12孔板中, 當細胞密度達到60%～80%時, 將DiI- Ac-LDL(10 μg/mL)分別和40倍濃度的DiI-Ac-LDL褐藻多糖硫酸酯(400 μg/mL)、陽性對照Ac-LDL (400 μg/mL)以及陰性對照LDL(400 μg/mL), 分別在冰上共同孵育30 min, 全程避光進行。棄掉上清液, 用PBS清洗細胞3次, 再用500 μL PBS重懸細胞, 經篩絹過濾后, 采用流式細胞儀(facs aria 2, BD Biosciences)上機分析。

2 結果

2.1 褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7的細胞活力和NO表達的影響

將濃度分別為25、50、100和200 μg/mL的FPS作用于RAW 264.7細胞24 h, 如圖1所示, 褐藻多糖硫酸酯作用于細胞之后均無細胞毒性, 且都能顯著性地促進NO的產生, 當FPS在100 μg/mL濃度時, NO的表達量達到最高。

2.2 褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7中細胞因子表達的影響

采用ELISA法對褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)作用于RAW 264.7細胞后, 細胞因子的表達檢測結果如圖2所示, 褐藻多糖硫酸酯可明顯促進巨噬細胞IL-6、IL-1β和TNF-α的表達。

圖1 褐藻多糖硫酸酯(25、50、100、200 μg/mL)對RAW 264.7的細胞活力和NO表達量的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。褐藻多糖硫酸酯作用RAW 264.7細胞24 h后, 采用MTT法檢測細胞活力, Griess試劑法檢測NO表達量。數據以獨立實驗的平均值±標準差(樣本數=3)表示。*表示<0.05, **表示<0.01, ***表示<0.005。

圖2 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)對RAW 264.7的細胞因子表達的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。褐藻多糖硫酸酯作用RAW 264.7細胞24 h后, 采用ELISA法檢測細胞因子表達。數據以獨立實驗的平均值±標準差(樣本數=5)表示。*表示<0.05, **表示<0.01, ***表示0.005。

2.3 轉錄組數據分析

分別從小鼠巨噬細胞RAW 264.7 FPS樣品組、LPS陽性對照組、以及CON未處理組中提取RNA, 每組各3個重復, 一共構建了9個轉錄組文庫(CON 1, CON 2, CON 3, LPS 1, LPS 2, LPS 3, FPS 1, FPS 2, FPS 3)。樣品經過上機測序后, 得到初始下機數據(raw data), 過濾去除低質量的數據(reads), 每個文庫保留3 400萬到4 400萬個高質量數據(clean reads), 且每個文庫中高質量數據占測序總數據的90%以上。Q30(堿基識別準確率在99.9%以上的堿基所占百分比)均在92%以上, 說明高質量數據的質量較好, 準確性較高, 滿足后續實驗分析的要求(表1)。

表1 轉錄組RNA測序數據質量及匹配結果

使用TopHat2軟件將高質量數據比對到參考基因組上, 匹配率見表1, 根據比對結果, 可知, 選擇的參考基因組合適, 且實驗不存在污染。

2.4 差異表達基因分析

根據基因表達差異分析的結果(同時滿足表達差異倍數|log2(差異表達倍數)|>1以及顯著性<0.05), 通過繪制差異表達基因的火山圖(圖3), 可知LPS處理后與CON組相比共有差異表達基因2 312個, 其中LPS組相對于CON組的差異表達基因上調1 095個, 下調有1 217個; FPS處理后與CON組相比共有差異表達基因982個, 其中FPS組相對于CON組的差異表達基因上調543個, 下調有439個; FPS處理后與LPS處理后相比共有差異表達基因848個, 其中FPS組相對于LPS組的差異表達基因上調338個, 下調有510個。

圖3 LPS vs CON, FPS vs CON和FPS vs LPS差異表達基因火山圖

注: 火山圖的橫坐標為log2(差異表達倍數), 縱坐標為–lg(值)。圖中兩條豎虛線為2倍表達差異閾值; 橫虛線為=0.05閾值。紅點表示該組上調基因, 藍點表示該組下調基因, 灰點表示非顯著差異表達基因。

2.5 差異表達基因的GO富集分析

為研究以上差異表達基因的功能, 我們使用topGO進行GO富集分析, 利用GO功能注釋的差異基因對每一個功能條目(GO term)的基因列表和基因數目計算, 通過顯著富集<0.05, 找出差異基因顯著富集的功能條目, 從而確定差異基因主要行使的生物學功能。

LPS處理組和CON組相比的差異表達基因(圖4a)與FPS處理組和CON組相比的差異表達基因(圖4b)的GO功能富集大致相似。在細胞組分中, 差異表達基因主要富集在細胞質、囊泡、細胞表面、內膜系統、高爾基體等; 在分子功能上, 差異表達基因主要富集在蛋白結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性、酶結合、信號受體結合、陰離子結合、蛋白質酪氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性等; 在生物過程上, 差異表達基因主要富集在免疫系統的過程、對外部生物刺激的反應、防御反應、免疫反應、物種間的相互作用、先天性免疫應答等。

2.6 差異表達基因的KEGG通路分析

以KEGG數據庫中的通路(pathway)為單位, 應用超幾何檢驗的方法, 通過對通路中富集到的差異基因個數與注釋到的基因個數的比值(rich factor, 富集系數)、值校正值(false discovery rate, FDR)和富集到該通路上的基因個數衡量富集的程度, 找出與整個基因組大背景相比, 差異表達基因中顯著性富集的通路。差異表達基因的KEGG通路富集分析氣泡圖如圖5所示, 選取FDR值最小, 即富集最顯著的前20個通路進行展示。

LPS處理組和CON組相比的差異表達基因(圖5a)與FPS處理組和CON組相比的差異表達基因(圖5b)主要富集的信號通路大致相似。富集在TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、NF-κB信號通路、細胞因子受體相互作用、C型凝集素受體通路、Toll樣受體信號通路等通路, 其中TNF信號通路和NF-κB信號通路富集程度最顯著。

2.7 目標蛋白的PRM靶向定量

共對LPS陽性對照組、FPS樣品組以及CON空白對照組提取蛋白, 每組各3個重復, 根據KEGG富集結果, 差異基因主要富集在Toll樣受體、TNF和NF-κB通路, 以及巨噬細胞表面主要模式識別受體為清道夫受體和Toll樣受體, 選取MSRE、MARCO、SCARA5、SCARA3和TLR4、TLR2和TLR13這7個目標膜蛋白進行了LC-PRM/MS分析, 得到了7個蛋白的2～5個可信肽段, 進行PRM靶向定量分析, 根據每條肽段的子離子峰面積, 對在不同組中的目標肽段和蛋白含量進行相對定量分析, 結果如圖6所示。

在選取的7個蛋白中, 當LPS作用于巨噬細胞RAW 264.7后, 清道夫受體中MSRE、MARCO、SCARA3的表達量顯著升高, Toll樣受體中TLR4、TLR2的表達量顯著升高; 當褐藻多糖硫酸酯作用于巨噬細胞RAW 264.7后, 清道夫受體中SCARA3的表達量顯著升高, Toll樣受體中TLR4的表達量顯著升高。

2.8 褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7中SR-A和TLR4表達的影響

MSRE、MARCO、SCARA3和SCARA5同屬于A類清道夫受體(SR-A), 但由于目前市面上并無針對具體分類的SR-A制備的熒光一抗, 且PRM靶向蛋白組學結果顯示當褐藻多糖硫酸酯作用后, SCARA3表達量升高, 故選取SR-A通用一抗進行流式驗證。

采用流式細胞儀進一步檢測褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)作用于RAW 264.7細胞后, 模式識別受體SR-A和TLR4的表達。結果如圖7所示, 褐藻多糖硫酸酯可以在促進SR-A和TLR4的表達, 與蛋白質組學的結果相對應。

2.9 褐藻多糖硫酸酯競爭結合清道夫受體

由于SCARA3不參與巨噬細胞的內化作用, 但褐藻多糖硫酸酯作用后其表達量升高, 故通過競爭結合實驗, 進一步探究褐藻多糖硫酸酯引起SCARA3表達量升高的原因。

研究表明, Ac-LDL是包括SR-A在內的多種清道夫受體的配體[14], 這些清道夫受體參與調節巨噬細胞對Ac-LDL的內化, 其中MSRE和MARCO發揮主要作用[15]。用熒光DiI標記Ac-LDL, 采用流式細胞術檢測褐藻多糖硫酸酯是否與Ac-LDL競爭性結合清道夫受體。

由圖8可知, Ac-LDL作為清道夫受體的配體, 降低了DiI-Ac-LDL的熒光強度; 而LDL則不能降低DiI-Ac-LDL的熒光強度。FPS同樣不能降低DiI-Ac-LDL的熒光強度, 可知FPS不能與Ac-LDL競爭性結合SR-A, 不能影響清道夫受體對Ac-LDL的內化。

圖4 LPS vs. CON (a)和FPS vs. CON (b)差異表達基因的GO富集分析柱狀圖

圖5 LPS vs CON和FPS vs CON差異表達基因的KEGG富集分析氣泡圖

注: 氣泡圖中橫坐標富集系數代表指該通路中富集到的差異基因個數與注釋到的基因個數的比值。富集系數越大, 表示富集的程度越大。FDR取值范圍為0～1, 越接近于零, 表示富集越顯著。

圖6 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)對RAW 264.7不同的模式識別受體表達的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。采用LC-PRM/MS檢測模式識別受體的表達。數據以獨立實驗的平均值±標準差(樣本數=3)表示。*表示<0.05, **表示<0.01, ***表示<0.005。

3 討論

免疫系統在清除和防御病原體中起到關鍵作用, 維持著機體健康。然而, 當機體對病原菌的抵抗能力不足, 機體免疫系統部分功能受損, 或當惡性腫瘤等疾病發生時, 僅僅依靠人體自身免疫系統發揮作用往往是無法應對的, 因此免疫增強和免疫調節尤為重要。

人體作為一個開放性的復雜大系統, 多種組織、器官及細胞相互作用、相互聯系, 共同協調對外部刺激的適應性反應以及進行生理功能調節。以往單純基于細胞模型對于免疫調節的研究有一定的局限性, 隨著近年來生命科學的發展, 轉錄組學技術和蛋白質組學技術的優勢日益顯現[16-17], 可以從整體水平上分析當受到免疫刺激時, 細胞內相關基因富集的生物功能、生物過程和信號通路, 以及定量相關蛋白的表達水平。從宏觀的角度闡述環境、藥物對細胞功能的影響, 了解細胞生命活動的一般規律。

圖7 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)對RAW 264.7細胞SR-A和TLR4表達的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。褐藻多糖硫酸酯作用RAW 264.7細胞24 h后, 采用流式細胞儀檢測。FlowJo V10軟件進行數據分析, 圖中數字代表與未處理組相比熒光強度的變化。

圖8 褐藻多糖硫酸酯是否與DiI-Ac-LDL競爭性結合清道夫受體

注: 加入DiI-Ac-LDL(10 μg/mL), 與褐藻多糖硫酸酯(400 μg/mL)、Ac-LDL(400 μg/mL)(陽性對照)或LDL(400 μg/mL)(陰性對照)分別于冰上避光孵育30 min后, 采用流式細胞儀檢測。采用FlowJo V10軟件進行數據分析, 圖中的數字代表與未處理組相比熒光強度的變化。

目前, 海藻多糖的免疫調節活性已有一定的研究基礎, Nakamura等[11]的研究表明墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯可以顯著提高iNOS和NO的表達, 在100 μg/mL時NO和iNOS的表達量最高。因此在本實驗中, 我們選取25、50、100和200 μg/mL濃度的褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬細胞RAW 264.7進行試驗。通過MTT法檢測其對巨噬細胞細胞活力的影響, 結果表明, 褐藻多糖硫酸酯在200 μg/mL的濃度以內對巨噬細胞RAW 264.7沒有細胞毒性。而且, 褐藻多糖硫酸酯在此濃度范圍都能顯著促進RAW 264.7中NO的產生, 具有良好的免疫調節活性, 且在100 μg/mL時, NO的表達量最高, 免疫刺激活性達到平臺期, 也能顯著促進IL-6、IL-1β和TNF-α的表達。因此, 在后續的轉錄組和蛋白組等實驗中, 我們選取100 μg/mL的濃度進行實驗。

通過轉錄組學的研究, 我們發現在褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7細胞后, 褐藻多糖硫酸酯給藥組相對于正常組的基因表達存在著顯著的差異, CON組和FPS組之間共有差異表達基因982個, 其中相對于CON組, FPS組的差異表達基因上調的有543個, 下調的有439個。通過GO富集和KEGG富集結果, 差異表達相關基因主要參與蛋白結合、離子結合等信號分子與蛋白的識別結合過程, 細胞因子活性、先天性免疫應答等免疫調節功能發揮、細胞因子受體相互作用、TNF信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體通路等信號通路傳導過程, 這些信號通路在免疫功能的發揮上起著不可或缺的作用。當褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7細胞后, 通過作用于巨噬細胞膜表面的某些蛋白, 引起NF-κB、TNF、Toll樣受體等免疫相關信號通路的變化以及細胞因子的分泌, 進一步引起細胞的免疫調節反應。

同時, 很多研究將褐藻多糖硫酸酯作用于細胞之后, 通過具體細胞實驗也進一步佐證了我們的轉錄組學結果。Ma等[18]表明羊棲菜來源褐藻多糖硫酸酯可引起巨噬細胞NO、活性氧(reactive oxygen species, ROS)以及細胞因子的產生, 引起免疫調節反應。Peng等[19]提出褐藻多糖硫酸酯復合物可以通過調節細胞因子分泌途徑, 促進RAW 264.7細胞的增殖, 增強機體的非特異性和特異性免疫。Miyazaki等[9]表明來源的褐藻多糖硫酸酯可能是通過與巨噬細胞膜表面模式識別受體相互作用, 進一步激活C型凝集素-1信號通路, 引起NO、TNF-α的表達, 增強巨噬細胞的免疫功能。

巨噬細胞免疫功能的發揮, 與模式識別受體清道夫受體和Toll樣受體能夠啟動巨噬細胞的免疫應答機制密切相關, 因此我們選取清道夫受體SR-A中的MSRE、MARCO、SCARA3和SCARA5以及Toll樣受體中的TLR2, TLR4和TLR13進行研究。A類清道夫受體是一種三聚體II型跨膜蛋白, 參與巨噬細胞復雜的代謝過程。MSRE在巨噬細胞中優先表達, 可以識別Ac-LDL、革蘭氏陽性菌和陰性菌等多種配體, 在多種疾病中發揮作用[15]。MARCO也可以結合Ac-LDL, 其在結構上與MSRE的不同之處在于它有一個更大的膠原結構域, 缺乏α-螺旋結構域。且MARCO可以與革蘭氏陽性菌和陰性菌相結合, 在先天性免疫中發揮作用[20]。SCARA5在結構上與MSRE和MARCO相似, 雖然參與免疫調節反應, 但與其他清道夫受體有著較大差異, 也不參與Ac-LDL的內化, 其在抑制腫瘤生長、腫瘤血管的生成方面具有重要作用[21]。SCARA3與其他SR-A不同, 不參與Ac-LDL的內化, 其主要功能是保護細胞免受活性氧的損傷[22]。Toll樣受體是Ⅰ型跨膜蛋白, 分為胞膜外區, 胞漿區和跨膜區三部分, 是免疫系統天然的模式識別受體, 通過識別病原相關分子模式, 調控免疫應答[23]。TLR4和TLR2位于細胞膜表面, 在免疫應答中相互作用, 通過識別脂蛋白等病原相關分子模式, 激活下游NF-κB、MAPK信號通路, 調節免疫反應[10]。TLR13位于細胞內溶酶體、內質網上, 近年來的研究表明, TLR13可以識別細菌內的23S核糖體保守序列, 具有免疫識別和調控的功能[24]。

在后續LC-PRM/MS對以上7種蛋白的相對定量蛋白組學研究中, 我們發現當褐藻多糖硫酸酯作用于巨噬細胞RAW 264.7后, 可以顯著性促進其表面的清道夫受體SR-A中的SCARA3以及Toll樣受體中TLR4的表達, 我們也通過流式對模式識別受體SR-A和TLR4的表達量進行了驗證, 發現褐藻多糖硫酸酯可以在不同程度上促進SR-A和TLR4的表達。Hsu等[25]發現墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯通過作用于TLR4, 激活下游ROS依賴的內質網應激通路, 進一步抑制腫瘤活力, 抑制癌細胞的生長。同樣, 海參來源的褐藻多糖硫酸酯作用于RAW264.7細胞后, 通過TLR2/4激活NF-κB通路, 進一步引起NO、TNF-α和IL-6的表達, 發揮免疫調節作用[10]。

在進行競爭性結合實驗時, 我們發現褐藻多糖硫酸酯并不能與Ac-LDL競爭結合SR-A, 說明褐藻多糖硫酸酯并不能直接與MSRE和MARCO結合。同時通過流式表征膜蛋白表達量的結果, 我們發現褐藻多糖硫酸酯可以顯著上調SCARA3的表達, 但是SCARA3不參與巨噬細胞的內化, 不是Ac-LDL的受體, 因此進一步佐證了褐藻多糖硫酸酯并不能結合SR-A。然而, Nakamura等[11]表明Sigma提供的墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯可以通過與SR-A結合, 激活p38 MAPK通路和NF-κB依賴通路, 誘導iNOS和NO的產生。我們推測, 產生這一差異的主要原因是兩種不同來源的褐藻多糖硫酸酯的化學組成和結構不同。其中, 墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯含有44.1%的巖藻糖, 26.3%的硫酸基, 主鏈結構為(1→3)和(1→4)連接的α-L-巖藻糖, 且主鏈中每隔兩到三個巖藻糖殘基就會有一個支鏈, 硫酸基取代的位置主要在C-2位和C-3位[26-27]。海帶來源的褐藻多糖硫酸酯含有29.12%的巖藻糖, 33.01%的硫酸基, 主鏈結構主要由(1→3)連接的α-L-巖藻糖組成, 也含有少量的(1→4)連接的α-L-巖藻糖, 支鏈繁多, 主要為巖藻糖或(1→6)連接的半乳糖, 以及相當量的其他單糖殘基; 硫酸基取代位置不均一, 可能存在C-2位、C-3位或C-4位, 雙取代的情況常見[4, 28]。因此, 不同來源的褐藻多糖硫酸酯的化學組成和結構的差異, 導致其與SR-A的結合情況不同。

此外, 模式識別受體之間的相互作用也可能導致了這一現象的發生。有研究報道, 褐藻多糖硫酸酯可以通過直接激活TLR4進一步引起下游通路的變化[25]。而且, Xu等[29]在研究中發現TLR2和TLR4介導的p38信號通路可以協同作用共同調節SR-A的水平。Amiel等[30]也表明TLR4介導先天性免疫應答, 通過MyD88信號通路, 進一步調控SR-A的吞噬作用。另外, SCARA3與其他A類清道夫受體的作用不同, 主要參與氧化應激反應, 保護細胞免受活性氧的侵害[22], SCARA3可能是通過這一途徑使褐藻多糖硫酸酯發揮免疫調節作用。褐藻多糖硫酸酯是否能與SCARA3直接結合還需進一步驗證。

4 結論

本文采用組學技術首次報道了海帶來源褐藻多糖硫酸酯對巨噬細胞基因水平的整體調控情況, 以及對主要膜蛋白的表達影響。研究結果表明, 褐藻多糖硫酸酯具有良好的免疫調節活性, 可以顯著促進NO和細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達。轉錄組共鑒定出差異表達基因982個, 上調的差異表達基因543個, 下調的差異表達基因439個, 且這些差異表達基因主要富集在信號分子與蛋白的識別結合過程、免疫調節功能發揮以及免疫相關信號通路的傳導過程。蛋白組學結果揭示了褐藻多糖硫酸酯可促進巨噬細胞表面膜蛋白清道夫受體SCARA3和Toll樣受體TLR4的表達, 流式結果和競爭結合實驗對其進行了佐證。研究結果為褐藻多糖硫酸酯在免疫調節和免疫增強中的應用提供了依據。

[1] WYNN T A, CHAWLA A, POLLARD J W. Mac-ro-phage biology in development, homeostasis and disea-se[J]. Nature, 2013, 496(7446): 445-455.

[2] FANG W S, BI D C, ZHENG R J, et al. Identification and activation of TLR4-mediated signalling pathways by alginate-derived guluronate oligosaccharide in RAW264.7 macrophages[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 1663.

[3] HAMASAKI S, KOBORI T, YAMAZAKI Y, et al. Effects of scavenger receptors-1 class A stimulation on macrophage morphology and highly modified advanced glycation end product-protein phagocytosis[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 5901.

[4] WANG J, ZHANG Q B, ZHANG Z S, et al. Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2008, 42(2): 127-132.

[5] YE J, CHEN D H, YE Z Cet alFucoidan isolated frominhibits LPS-induced inflammation in macrophages via blocking NF-kappaB, MAPK and JAK-STAT pathways[J]. Marine Drugs, 2020, 18(6): 328.

[6] HAN J G, SYED A Q, KWON M, et al. Antioxident, immunomodulatory and anticancer activity of fucoidan isolated from[J]. Journal of Biotechnology, 2008, 136(Sup): S558-S576.

[7] WANG J, ZHANG Q B, ZHANG Z S, et al. Potential antioxidant and anticoagulant capacity of low molecular weight fucoidan fractions extracted from[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2010, 46(1): 6-12.

[8] JIN W H, WANG J, JIANG H, et al. The neuroprotective activities of heteropolysaccharides extracted from[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 97(1): 116-120.

[9] MIYAZAKI Y, IWAIHARA Y, BAK J, et al. The coo-perative induction of macrophage activation by fucoi-dan derived fromand beta- glucan derived from[J]. Bio-chemical and Biophysical Research Communications, 2019, 516(1): 245-250.

[10] JIANG S X, YIN H N, LI R, et al. The activation effects of fucoidan from sea cucumberon RAW264.7 cells via TLR2/4-NF-kappaB path-way and its structure-activity relationship[J]. Carbohydrate Polymers, 2021, 270: 118353.

[11] NAKAMURA T, SUZUKI H, WADA Y, et al. Fucoidan induces nitric oxide production via p38 mitogen-activated protein kinase and NF-κB-dependent signaling pathways through macrophage scavenger receptors[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 343: 286-294.

[12] CHEN X, LAI Y L. A censored-Poisson model based approach to the analysis of RNA-seq data[J]. Quan-tita-tive Biology, 2020, 8(2): 155-171.

[13] AEBERSOLD R, MANN M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function[J]. Nature, 2016, 537(7620): 347-355.

[14] NISHINAKA T, MORI S, YAMAZAKI Y, et al. A comparative study of sulphated polysaccharide effects on advanced glycation end-product uptake and scavenger receptor class A level in macrophages[J]. Diabetes & Vascular Disease Research, 2020, 17(1): 1479164119896975.

[15] CANTON J, NECULAI D, GRINSTEIN S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity[J]. Nature Reviews Immunology, 2013, 13(9): 621-634.

[16] ZHAI Y F, XU R H, HE P M, et al. A proteomics investigation of 'immune priming' inas shown by isobaric tags for relative and absolute quantification[J]. Fish Shellfish Immunol, 2021, 117: 140-147.

[17] QI L J, CHEN Y D, SHI K P, et al. Combining of transcriptomic and proteomic data to mine immune-related genes and proteins in the liver ofchallenged with[J]. Compa-rative Biochemistry and Physiology - Part D: Geno-mics and Proteomics, 2021, 39: 100864.

[18] MA W P, LI H H, LIU M, et al. Effects of simulated digestion in vitro on the structure and macrophages activation of fucoidan from[J]. Carbohydrate Polymers, 2021, 272: 118484.

[19] PENG Y B, SONG Y F, WANG Q K, et al. In vitro and in vivo immunomodulatory effects of fucoidan compound agents[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 127: 48-56.

[20] GOUGHA P J, GORDON S. The role of scavenger receptors in the innate immune system[J]. Microbes and Infection, 2000, 2: 305-311.

[21] 史子敏, 朱安義, 洪正東. SCARA5的研究進展[J]. 廣東醫學, 2018, 39(24): 3724-3726.

SHI Zimin, ZHU Anyi, HONG Zhengdong. Research progress of SCARA5[J]. Guangdong Medical Journal, 2018, 39(24): 3724-3726.

[22] ALQURAINI A, KHOURY J E. Scavenger receptors[J]. Current Biology, 2020, 30(14): R790-R795.

[23] 周慶, 郝璐, 周澤強. 固有免疫系統Toll樣受體的研究進展[J]. 生物學雜志, 2016, 33(3): 83-87.

ZHOU Qing, HAO Lu, ZHOU Zeqiang. Research progress of Toll-like receptor in innate immune system[J]. Journal of Biology, 2016, 33(3): 83-87.

[24] LI X D, CHEN Z J. Sequence specific detection of bacterial 23S ribosomal RNA by TLR13[J]. eLife, 2012, 1: e00102.

[25] HSU H Y, LIN T Y, LU M K, et al. Fucoidan induces Toll-like receptor 4-regulated reactive oxygen species and promotes endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis in lung cancer[J]. Scientific Reports, 2017, 744990.

[26] BLACK W A P, DEWAR E T, WOODWARD F N. Ma-nufacture of algal chemicals. IV ?Laboratory-scale iso-lation of fucoidin from brown marine algae[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1952, 3(3): 122-129.

[27] PATANKAR M S, OEHNINGER S, BARNETT T, et al. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities[J]. Journal of Biological Chemistry, 1993, 268(29): 21770-21776.

[28] WANG J, ZHANG Q B, ZHANG Z S, et al. Structural studies on a novel fucogalactan sulfate extracted from the brown seaweed[J]. Internatio-nal Journal of Biological Macromolecules, 2010, 47(2): 126-131.

[29] XU W Y, WANG L, WANG H M, et al. TLR2 and TLR4 agonists synergistically up-regulate SR-A in RAW264.7 through p38[J]. Molecular Immunology, 2007, 44(9): 2315-2323.

[30] AMIEL E, ALONSO A, UEMATSU S, et al. Pivotal advance: Toll-like receptor regulation of scavenger receptor-A-mediated phagocytosis[J]. Journal of Leu-kocyte Biology, 2009, 85(4): 595-605.

Transcriptomic and proteomic analysis of the immunomodulatory effects of fucoidan extracted fromin RAW 264.7 cells

CUI Mei-yu1, 2, 3, GENG Li-hua1, 2, ZHANG Quan-bin1, 2

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

is a significantly economical brown seaweed found in China, and fucoidan extracted fromhas various biological effects, including immunomodulatory. However, few reports are based on omics.In this study, RNA-Sequencing (RNA-Seq) transcriptome technique and parallel reaction monitoring (PRM) relative quantitative proteomics method were used to investigate the effects of fucoidan on the functions and pathways of RAW 264.7 cells.The results showed that the differentially expressed genes were enriched in biological processes, such as the immune response, innate immune response, TNF, NF-κB, and toll-like receptor signaling pathways. We observed that fucoidan promoted the expression of the scavenger receptor class A member 3 and toll-like receptor 4 in RAW 264.7 cells. The expression levels of SR-A and TLR4 in fucoidan-treated RAW 264.7 were verified by flow cytometry. This showed that the expression levels of SR-A and TLR4 increased, confirming the omics' results reliability. The results of this study provided a theoretical basis for developing functional food products or drugs with the immunomodulatory effects of fucoidan.

fucoidan; macrophage; immunomodulatory; transcriptomics; proteomics

Mar. 4, 2022

R285.5

A

1000-3096(2022)11-0094-13

10.11759/hykx20220304004

2022-03-04;

2022-04-20

山東省重大科技創新工程項目(2019JZZY010818)

[Shandong Province Major Science and Technology Innovation Project, No. 2019JZZY010818]

崔美玉(1997—), 女, 河北滄州人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物學研究, E-mail: 18831293920@163.com; 張全斌(1971—),通信作者, 男, 山東章丘人, 研究員, 主要從事海藻化學與海洋藥物研究, E-mail: qbzhang@qdio.ac.cn

(本文編輯: 趙衛紅)