宏基因組高通量測序檢測自體造血干細胞移植后感染嗜肺軍團菌1 例及文獻復習

趙海濤 王瑞芳 鄭永青 孫明東

嗜肺軍團菌是軍團菌病的主要病原體，大多為社區獲得性感染，該菌培養條件苛刻，培養時間長、陽性率低，是一種常見的誤診病原體，特別是應用免疫抑制劑及免疫力低下的患者，易導致重癥肺炎，甚至死亡，因此及時準確的診療具有重要意義。宏基因組高通量測序（mNGS）技術具有無偏移性、廣覆蓋、高效率、陰性預測價值高等理論優勢，對混合感染、罕見病原體和苛養病原體的鑒定優勢較大，為臨床診療提供了有力保障。

病例介紹：男，26 歲，既往體健；2020-07-04 因“乏力2 周，活動后明顯”入院，無心慌、胸悶等不適；查體：神志清、精神可，貧血貌，面色蒼白，眼瞼結膜蒼白，多處淺表淋巴結腫大，活動可，無壓痛。心肺聽診（-），腹軟，無壓痛及反跳痛，肝脾肋下未及；輔助檢查：2020-07-04 血常規:WBC 6.66×109/L，HGB 61.00g/L，PLT 138.00×109/L；2020-07-05 外周血幼稚粒細胞易見；EB-DNA 4.02E+02（Copies/ml）、CMV-DNA（-）；CD55、CD59 均為陰性；胸腹部CT示：頸部、鎖骨上下區、縱隔、椎旁、腹膜后、右側腹股溝區多發腫大淋巴結，脾大，提示淋巴瘤；病理學檢查（左頸部淋巴結）提示可見淋巴組織增生性病變，結合免疫表型：CD15（-）、CD30（+）、PAX-5（+）、CD3（+）、CD20（散在陽性）、CD21（提示濾泡樹突網破壞）、BCL-6（-）、MUM-1（+）、Ki-67 增殖指數約20%；考慮為經典型霍奇金淋巴瘤（結節硬化型）；原位雜交：EBER1/2-ISH（大細胞+）；骨髓細胞學檢查提示：增生活躍骨髓象，細胞形態未見明顯異常；骨髓流式免疫學送檢標本流式分析未檢測到明顯的急性白血病、NHL 和高危MDS 相關免疫表型改變；染色體：46，XY；診斷為：經典型霍奇金淋巴瘤（結節硬化型 Ⅳ期A 組 EBER+）；先后給予一線治療：ABVD 方案行2 個療程，2020-09-21 行CT 提示PR，繼續行ABVD 方案化療2 療程，2021-10-30 行PET-CT 評估療效為：Deauvile 4 分；CT 提示病灶仍為PR；考慮屬于難治性淋巴瘤，二線治療：PD-1 單抗+ICE（異環磷酰胺+卡鉑+依托泊苷）方案化療2 療程（2020-12-03～2021-02-16），行胸腹部CT 檢查提示疾病明顯改善，但肺部出現結節，繼續完成2 個療程方案化療，行PET-CT 提示完全代謝緩解（CR），CT 提示未見殘留病灶。根據2020版中國淋巴瘤專家共識及2020 版NCCN 指南推薦，屬于難治性淋巴瘤，建議血自體外周造血干細胞移植，暫未同意；于2021-04-12 復查胸部CT 提示：右肺片狀陰影，考慮不排除真菌感染（圖1），給予頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉+卡泊芬凈抗感染治療，鑒于嚴重的骨髓抑制及肺部感染先后2 次行PD-1 單藥維持治療；治療后復查胸部CT 提示：右肺下葉結節消失；并再次建議自體外周血造血干細胞移植；于2021-07-21 給予HD-CTX+G-CSF，并行外周血干細胞CD34+1.96×106/kg 采集基本成功；2021-08-05 給予完善PET-CT 檢查，提示CR。于2021-09-13 復查胸部CT 提示右肺片狀陰影較前明顯消退（圖2）；充分評估病情，完善移植前評估，無移植禁忌證，完成移植前卡氏肺囊腫、寄生蟲等的預防。于2021-09-22 開始給予標準BEAM 方案為預處理方案；鑒于既往真菌感染病史，給予口服泊沙康唑口服液 5ml tid 預防真菌感染。于2021-09-30 開始輸注外周血造血干細胞：CD34+1.96×106/kg；輸注后第5d，大便偏稀，不成形，略有低熱，體溫37.9℃，無咳嗽、咳痰，無心慌、胸悶等不適癥狀，查體：雙肺聽診未聞及明顯干濕性啰音，心率80～90次/min，心律齊，未聞及雜音；輔助檢查：血常規示：WBC 0.04×109/L、HGB 117g/L、PLT 290.04×109/L；降鈣素原：0.104ng/ml；G-脂多糖：＜5pg/ml；半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）試驗：0.184μg/L 并留取血培養；根據2020 版中國中性粒細胞缺乏伴發熱患者抗菌藥物臨床應用指南提示患者屬于高危組，給予美羅培南，并輔以退熱抗感染治療，患者體溫一過性好轉，于第10d 患者出現再次發熱，最高體溫38.3℃，伴有咳嗽，無畏寒，聽診雙肺下葉可聞及濕性啰音，左肺明顯，心率90～100 次/min，血常規示：WBC 0.67×109/L、HGB 92g/L、PLT 29×109/L，提示白細胞開始植入，患者行美羅培南抗感染療效差，不排除球菌感染可能，給予萬古霉素1.0g q12h抗感染治療，并輔以退熱治療，于2021-10-11（第11d），復查血常規提示：WBC 2.00×109/L、HGB 94g/L、PLT 19×109/L；CRP 248.77mg/L；血清淀粉樣蛋白A（SAA）：300.00mg/L；降鈣素原：0.159ng/ml；EB 病毒陰性、巨細胞病毒陰性；第12d 復查血常規示：WBC 3.29×109/L、HGB 104g/L、PLT 21×109/L；提示中性粒細胞植活，脫離粒細胞缺乏，仍有反復高熱不退，行胸部CT 提示：右肺下葉大片炎性占位，左側為著（圖3）。先后2 次行血培養、痰培養均為陰性，鑒于患者既往真菌感染病史，不排除真菌感染加重、卡氏肺囊腫及耐碳青霉烯類感染可能，停美羅培南、萬古霉素抗感染治療后調整為替加環素聯合頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗感染治療，給予伏立康唑聯合卡泊芬凈抗感染治療；于第14d 查血常規示：WBC 4.23×109/L、HGB 96g/L、PLT 34×109/L；CRP 289.85mg/L；SAA 300.00mg/L；降鈣素原：8.35ng/ml；痰檢陰性；復查胸部CT 提示：雙肺炎癥較前明顯進展，行抗感染治療后，體溫較前略有降低，但降鈣素原嚴重偏高，第18d（2021-10-18）行血常規示：WBC 3.15×109/L、HGB 81g/L、PLT 36×109/L；（1-3）-β-D 葡聚糖：＜10 pg/ml；GM 試驗：0.385μg/L，CRP 238.85mg/L；SAA 189.41mg/L，降鈣素原1.460 ng/ml；EB 病毒1.17E+02、巨細胞病毒陰性;痰檢陰性；血培養陰性；降鈣素原明顯降低，但患者仍有反復發熱，伴有喘憋，鼻導管吸氧，心率120～130次/min，輕微活動即感胸悶不適，積極聯系呼吸科行肺泡灌洗聯合NGS 檢查明確病原菌；于第19d（2021-10-19）患者行胸部CT 提示肺炎進展（圖4），肺泡灌洗及NGS 檢測，支氣管鏡下圖像提示：支氣管、氣管可見散在出血點，伴有粘液痰栓（圖5）；第23d NGS 提示：嗜肺軍團菌；調整治療方案為左氧氟沙星0.6g qd，聯合伏立康唑、舒普深抗感染治療，癥狀明顯改善；于2021-11-18 出院；鑒于患者自體造血干細胞移植后免疫重建約3 個月，出院后繼續口服左氧氟沙星片鞏固治療，于2021-12-01門診隨診胸部CT 提示雙肺炎癥明顯改善（圖6），目前患者仍處于隨訪觀察中。

圖1 右肺下葉結節性占位（2021-04-12）

圖2 右肺下葉結節性病灶較前明顯消退（2021-09-13）

圖3 患者左肺下葉團塊樣占位（2021-10-12）

圖4 患者肺部感染明顯加重，右下肺占位增大，并出現左側肺部炎癥感染（2021-10-19）

圖5 支氣管內可見散在出血點，伴有絲狀粘液栓

圖6 雙肺炎癥明顯好轉，左肺下葉仍可見實變，伴有空洞（2021-12-01）

討論軍團菌是一種需氧、革蘭氏陰性、寄生于人體單核細胞和巨噬細胞內的機會性致病菌，大致分為嗜肺軍團菌和非嗜肺軍團菌，往往導致重癥肺炎，特別是免疫力低下的患者，90%以上的致病菌是由嗜肺軍團菌引起的，主要分Lp1、Lp4 和Lp6等3 個血清群，Lp1 導致50%～80%的軍團菌病。軍團菌廣泛存在于自然環境中，包括水源和土壤等，水源是軍團菌的主要感染源，包括飲用水供水系統、人工氣溶膠的冷卻塔等，人類主要通過吸入霧化氣溶膠的含菌飛沫或飲用含菌水源而得病，人體主要通過體液免疫及細胞免疫對抗軍團菌，其中細胞免疫起主導作用，當細胞介導的免疫受損的患者（例如移植受者）更易感染軍團菌；在一項長達13年的回顧性研究中分析了49 例伴嗜肺軍團菌肺炎腫瘤患者，其中82%為血液腫瘤患者，37%為接受骨髓移植的患者[1]。本研究中該患者屬于難治性霍奇金淋巴瘤，根據2020 年NCCN 指南[2]及中國霍奇金淋巴瘤專家CSCO 共識具有行自體外周血造血干細胞移植治療指征，行自體造血干細胞移植治療后患者三系嚴重低下，粒細胞缺乏，伴有腹部不適，大便偏稀，發熱，根據2020 版中國中性粒細胞缺乏伴發熱患者抗菌藥物臨床應用指南提示屬于高危組，具有碳青霉烯類抗生素抗感染治療指征，同時既往具有肺部真菌感染病史，給予泊沙康唑預防真菌治療，治療過程中略有好轉后體溫再次反復高熱，聯合萬古霉素抗感染治療，療效欠佳，且病情未見好轉，降鈣素原8.35ng/ml，多次咽拭子、痰培養、血培養均為陰性，不排除耐碳青霉烯類病原菌可能，給予調整抗生素為替加環素聯合頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉抗感染治療，復查炎癥指標，降鈣素原較前明顯改善，但患者癥狀未見明顯好轉，考慮疾病及影像學的滯后性，為進一步明確診斷，聯系呼吸科行肺泡灌洗聯合NGS 檢測，肺泡灌洗培養提示陰性，NGS提示嗜肺軍團菌，參考2016 中國社區獲得性肺炎抗感染治療指南[3]，喹諾酮類或大環內酯類藥物被認為是軍團菌肺炎患者的一線治療選擇，對于危重或免疫功能低下的患者推薦聯合治療[4]。患者經喹諾酮類藥物抗感染治療后，癥狀明顯改善。

軍團菌病是一種非典型性肺炎，具有非特異性的影像學和臨床表現，除引起肺部感染外，直接或間接影響多個器官的系統性感染，包括中樞神經系統、心臟、肝、胃腸道和腎臟等，臨床診斷金標準仍是分離得到軍團菌，因為軍團菌在細胞內寄生，營養要求較高，培養周期較長，陽性培養率僅為5%[5]，容易產生假陰性結果；目前軍團菌的診斷幾乎完全依賴于尿抗原檢測，尿抗原檢測特異性較高，但僅能檢測嗜肺軍團菌Lp1 型，且在專門的實驗室亦有30%假陰性率；同時為非Lp1 菌株引起的軍團菌病創造了一個診斷性的“盲點”，存在漏檢的可能，仍需與其他檢測方法聯合檢驗；其次為血清學檢查，特異性抗體檢測操作簡便，特異性強，但血清學抗體增加大約需要2～4 周，且移植后患者免疫力低下，常在感染軍團菌時早期難以產生足夠抗體可供檢測，在免疫缺陷患者的檢測中具有局限性[6]。本例患者移植后出現嚴重感染，多次血培養、痰及肺泡灌洗液培養均為陰性，進一步從側面證實了傳統常規培養、檢測方法診斷軍團菌的局限性；Cunha 等認為可通過臨床表現，如體溫＞38.9℃伴相對心動過緩，低鈉、低磷血癥，鐵蛋白水平升高，肌酐磷酸激酶升高、顯微鏡下血尿等是特征性的臨床表現來判斷，每項賦值1 分，大于3 分診斷的可能性大，特征性表現越多，越具有診斷意義[7]。本例患者除了低鈉血癥外，未見典型的臨床表現，臨床診斷亦存在局限性；其他的檢測方法包括聚合酶鏈反應（PCR）、免疫熒光探針、二代測序等。Erat 等[8]報道1 例重型地中海貧血異基因造血干細胞移植患者院內獲得性軍團菌感染，在供水系統中通過PCR 檢測到嗜肺軍團菌，血清型為2-14，但PCR 檢測針對性強，目前在國內大多數醫院還沒有開展。mNGS 技術具有無偏移性、廣覆蓋、高效率、陰性預測價值高等理論優勢，對混合感染、罕見病原體和苛養病原體的鑒定優勢較大，目前越來越多的報道均通過mNGS得到證實[9～11]；本例患者通過肺泡灌洗液檢測到嗜肺軍團菌感染，未見其他菌群，給予左氧氟沙星抗感染治療后，患者癥狀明顯改善，為臨床診療提供了有力保障。

目前，血液惡性腫瘤患者仍需化療、聯合分子靶向治療，甚至移植才能治愈，常導致嚴重骨髓抑制、機體免疫力低下或應用免疫抑制劑抑制急慢性GVHD 等，易導致細胞免疫及體液免疫功能不全，繼發嚴重感染，對于混合感染、罕見病原體及苛養菌診斷仍具有挑戰性，mNGS 技術是常規檢測方法的有益補充，但mNGS 技術成熟應用于臨床尚有許多問題需要解決，如價格貴、分析方法缺乏規范性及標準化，如何質控管理、剔除人類基因組干擾、背景雜菌污染等，有待于逐步解決這些問題后更好地應用于臨床。