基于TCGA數據分析NEK2基因在惡性胸膜間皮瘤中的表達及預后意義

【摘要】 目的分析永不有絲分裂基因A相關激酶2（NEK2）基因在惡性胸膜間皮瘤（MPM）中的表達及預后意義。 方法下載癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫MPM基因表達數據、臨床病理數據和生存狀態數據；使用perl軟件和R語言的limma、timeROC等程序包作NEK2基因在MPM中的差異分析、臨床病理相關性分析、COX單因素和多因素分析以及基因富集分析，并繪制ROC曲線；利用TIMER2.0數據庫分析MPM中NEK2表達與常見的免疫細胞浸潤的相關性。選取12例MPM組織和6例非MPM胸膜組織，通過RT-qPCR的方法驗證NEK2基因在MPM與非瘤組織中的表達情況。 結果與正常肺組織相比，NEK2在MPM組織中高表達（Plt;0.001）。NEK2基因mRNA表達量與MPM淋巴結分期具有顯著相關性（Plt;0.05）；NEK2高表達與MPM患者預后不良相關（Plt;0.001）；NEK2基因表達與MPM中B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞浸潤水平呈正相關（Plt;0.05），并在細胞周期、DNA復制、剪接體、mRNA監測等通路顯著富集。在收集到的病例樣本中，與非MPM胸膜組織相比，NEK2基因在MPM組織中的表達量顯著增高（Plt;0.01）。 結論NEK2在MPM組織中高表達，且NEK2在MPM中高表達提示預后不良，可能成為治療MPM的潛在靶點。

【關鍵詞】惡性胸膜間皮瘤；永不有絲分裂基因A相關激酶2；癌癥基因組圖譜；預后；生物信息學

中圖分類號： R734.3文獻標志碼： ADOI： 10.3969/j.issn.1003-1383.2024.02.002

Analysis of expression and prognostic significance of NEK2 gene in malignant pleural mesothelioma based on TCGA data

LI Jinsong1， 2， 3， LI Bin1， 2， 3， LIU Ruai1， 2， PU Yuanqian1， 2， ZI Jiaji1， 2， YU Min4， XIONG Wei1， 2， 3

【Abstract】 ObjectiveTo analyse the expression and prognostic significance of the never-expressed mitogen A-related kinase 2 （NEK2） gene in malignant pleural mesothelioma （MPM）. MethodsThe gene expression data， clinicopathological data and survival status data of MPM were downloaded from the cancer genome atlas （TCGA） database， and perl software and R language packages such as limma and timeROC were used to make differential analysis of NEK2 gene in MPM， clinicopathological correlation analysis， COX unifactorial and multifactorial analysis as well as gene set enrichment analysis， and the ROC curve was plotted; and TIMER2.0 database was used to analyze" correlation between NEK2 expression in MPM and common immune cell infiltration. 12 MPM tissues and 6 non MPM pleural tissues were selected， and the expression of NEK2 gene in MPM and non tumor tissues was" verified by RT-qPCR. ResultsNEK2 was highly expressed in MPM tissues compared with normal lung tissues （Plt;0.001）. mRNA expression of NEK2 gene was significantly correlated with MPM lymph node staging （Plt;0.05）， high expression of NEK2 was correlated with poor prognosis of MPM patients （Plt;0.001）; and the expression of NEK2 gene was positively correlated with the infiltration levels of B-lymphocytes， macrophages， and dendritic cells in MPM （Plt;0.05）， and they were significantly enriched in pathways such as cell cycle， DNA replication， spliceosome， mRNA monitoring， etc. In the collected case samples， compared with non MPM pleural tissue， the expression level of NEK2 gene in MPM tissue was significantly increased （Plt;0.01）. ConclusionNEK2 is highly expressed in MPM tissues， and the high expression of NEK2 in MPM suggests a poor prognosis， which may be a potential therapeutic target for MPM.

【Keywords】malignant pleural mesothelioma（MPM）; never-expressed mitogen A-related kinase 2 （NEK2）; the cancer genome atlas （TCGA）; prognosis; bioinformatics

間皮瘤是起源于人體漿膜層間皮細胞的罕見、難治性惡性腫瘤，依據來源部位可分為胸膜間皮瘤、腹膜間皮瘤、心包間皮瘤、睪丸間皮瘤等，其中最常見的是胸膜間皮瘤。惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）依據組織分型可分為上皮型、肉瘤型及雙相型，主要病因是長期石棉暴露，盡管石棉在許多國家被禁止開采，但世界范圍內的發病率和病死率仍居高不下［1］。MPM診斷的金標準是胸腔鏡活檢，由于難以診斷，確診時患者常處于晚期，具有長達40年的潛伏期，確診后中位生存期為1年，預后極差［2］。除了石棉暴露，MPM的另一顯著改變是CDKN2A、BAP1等腫瘤抑制基因的高頻缺失或突變［3］。因此，探索MPM的特異標志物對MPM的早期診斷和臨床治療具有重要意義。

永不有絲分裂基因A相關激酶2（never in mitosis gene A-related kinase 2， NEK2）基因位于1q32.2，包含9個外顯子，其編碼的蛋白質定位于中心體，參與細胞周期調控。NEK2的結構與永不有絲分裂基因A（NIMA）相似，在氨基端有絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域，以及一系列如亮氨酸拉鏈、螺旋卷、磷酸酶結合位點的調節基序［4］。NEK2通過磷酸化調節中心體的聚合和解聚，與G2/M期中心體的分離有關，過表達或可導致染色體異常和異倍體［5］。除此之外，NEK2過表達可活化諸如PP1/AKT、WNT、β-catenin、RAS、SRC等促癌信號通路，促進細胞增殖、侵襲、轉移以及藥物抵制［6］。NEK2過表達可誘導漿膜層侵襲、淋巴結轉移和腹膜播散的發生［7］，在體外或體內敲低NEK2基因在多種類型的腫瘤中取得良好的治療效果［8］。然而，目前NEK2在MPM中的作用機制尚不明確。本研究主要探討NEK2在MPM中的表達水平及預后意義，利用組織樣本驗證NEK2在MPM與非瘤胸膜組織中的表達水平，并通過生物信息學探究其潛在的生物學功能及在腫瘤微環境中與免疫浸潤的關系，為MPM的臨床診斷和預后評估等醫療實踐提供理論基礎和實驗依據。

1 資料與方法

1.1 NEK2基因在正常肺組織與間皮瘤組織的mRNA表達量差異分析

通過UCSC Xena網站（https：//xena.ucsc.edu/）下載癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫中正常肺組織與MPM組織基因表達數據（TCGA-MESO.htseq_fpkm.tsv.gz）；使用perl軟件轉換表達數據基因的ID；在R 4.3.1軟件中運行limma和ggpubr程序包提取表達數據中的NEK2基因表達量并分組比較正常與腫瘤樣本的NEK2基因表達水平。

1.2 NEK2基因表達水平與MPM患者臨床病理相關性分析

運行R 4.3.1軟件中的cgdsr和epicalc程序包，從網站（https：//www.cbioportal.org/）獲取TCGA數據庫中的MPM數據集（meso_tcga_pan_can_atlas_2018）。提取NEK2基因的mRNA表達量（meso_tcga_pan_can_atlas_2018_rna_seq_v2_mrna）和相關臨床病理數據；根據NEK2基因表達量的中位值分為高表達組和低表達組并利用患者ID合并表達量數據與臨床病理數據，篩查和注釋數據后作相關性統計學分析。

1.3 NEK2基因在MPM中的臨床病理參數可視化

通過UALCAN網站（https：//ualcan.path.uab.edu/index.html），選擇TCGA模塊，輸入NEK2基因并選擇MESO數據集，單擊expression分析，作圖得到NEK2基因表達量與不同MPM臨床病理分組相關性的箱型圖。

1.4 NEK2基因表達水平與MPM患者預后相關性分析

進入GEPIA官網（http：//gepia.cancer-pku.cn/），在單基因分析模塊輸入NEK2基因，選擇生存曲線作圖，保持95%置信區間，添加MESO數據庫并單擊plot作圖。

1.5 NEK2基因表達水平與免疫細胞浸潤相關性分析

進入TIMER 2.0官網（http：//timer.cistrome.org/），選擇免疫相關分析，在基因模塊輸入NEK2基因，勾選純度分析，選擇MESO腫瘤類型，篩選具有統計學意義的免疫細胞并作圖。

1.6 基因富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）

把TCGA數據庫MPM 樣本按照NEK2 基因mRNA表達量的中位數分為高表達組和低表達組，并對兩組進行差異分析，根據處理后基因的 logFC 值從大到小排序，序列上部是上調的差異基因，序列下部是下調的差異基因，進行GSEA分析。計算基因集的富集分數（enrichment score，ES），對基因集的 ES 值顯著性檢驗，估計ES的顯著性。最后進行多重假設檢驗，根據基因集的大小對ES標準化，得到標準化后富集分數（normalized enrichment score，NES），隨后用NES計算假陽性率，從而得到顯著富集的基因集。

1.7 ROC曲線分析繪制

通過UCSC Xena網站（https：//xena.ucsc.edu/）數據庫模塊下載TCGA數據庫中的MPM基因表達數據（TCGA-MESO.htseq_fpkm.tsv.gz）和生存狀態數據（TCGA-MESO.survival.tsv）；使用perl軟件注釋基因表達數據樣本ID；在R 4.3.1軟件中運行limma包提取NEK2基因在MPM中的表達量，并根據樣本ID合并基因表達數據和生存狀態數據，使用survival， survminer和timeROC包繪制NEK2基因在MPM診斷中的受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）并得出曲線下面積（aera under the curve，AUC）。

1.8 臨床資料

選取大理大學第四附屬醫院（楚雄彝族自治州人民醫院）自2020年6月至2022年12月手術切除的12例MPM組織及6例非MPM（包括肺大皰、肺結核等疾病）患者的胸膜組織作為對照。納入標準：①病理檢查確診為MPM患者；②患者臨床病例資料及手術標本組織保存完整。排除標準：①合并其他系統腫瘤患者；②術后30天內死亡的MPM患者。所有MPM患者術前均未進行放療、化療、激素治療和其他相關抗腫瘤治療。納入本研究之前，所有患者簽署書面知情同意。本研究已獲大理大學附屬醫院聯盟醫學倫理委員會的批準（批準號：2020-YXLL20）。

1.9 NEK2在MPM組織與非MPM胸膜組織中的表達差異

利用Trizol法提取各組織中的總RNA，并進行逆轉錄獲得cDNA，設計并合成NEK2引物，然后進行RT-qPCR實驗。結果可通過2-△△Ct反映出各個MPM組織樣本與非MPM胸膜組織樣本中NEK2基因的相對表達水平。實驗重復3次。

1.10 統計學方法

本研究的數據統計分析使用R4.0.2軟件或GraphPad Prism 8.0軟件。計量資料采用均數±標準差（ ±s）表示，其兩組間比較采用正態t檢驗，多組間比較采用卡方檢驗。使用Kaplan-Meier模型和Log-rank檢驗進行生存分析。運用卡方檢驗及雙向無序R×C表資料的Fisher確切概率法分析NEK2基因表達水平與MPM患者臨床病理參數的相關性。建立COX回歸模型對MPM患者臨床病理參數進行單因素和多因素分析。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 NEK2基因mRNA在MPM組織中顯著高表達

分析對比TCGA數據庫中正常肺組織（n=49）與MPM組織（n=87）的NEK2基因mRNA表達量得出，與正常肺組織樣本相比，NEK2基因在MPM組織中顯著高表達（P=2.22×10-16）。見圖1。

2.2 NEK2基因mRNA表達水平與MPM患者臨床病理參數的相關性

TCGA數據庫中MPM數據集87例患者的分析結果表明，NEK2基因mRNA表達水平與MPM患者年齡、性別、組織分型等無顯著相關性（Pgt;0.05），而與MPM患者腫瘤淋巴結轉移N分期具有顯著相關性（Plt;0.05）。見表1。

2.3 NEK2基因在MPM中的表達模式

UALCAN數據庫分析結果表明，NEK2基因表達量與MPM的腫瘤分期、性別、腫瘤類型、淋巴結轉移狀態和TP53基因突變狀態無顯著相關性；而NEK2基因表達量與MPM患者的年齡具有顯著相關性，其中NEK2基因表達量在81～100歲MPM患者中的表達量顯著高于41～60歲MPM患者中的表達量（P=0.008）。見圖2。

2.4 NEK2高表達與患者預后不良顯著相關

基于TCGA數據庫的總體生存率（overall survival，OS）分析結果顯示，與NEK2低表達組相比，NEK2高表達組患者生存率隨著時間延長呈現顯著下降（Log-rank，Plt;0.001）。無疾病進展生存率（disease free survival， DFS）分析結果顯示，與NEK2低表達組相比，NEK2高表達組生存率也隨著時間延長而顯著下降（Log-rank，Plt;0.05）。由此可知，NEK2基因高表達提示MPM患者預后不良。見圖3。

2.5 影響MPM患者預后的單因素和多因素分析

從TCGA數據庫獲取87例MPM患者臨床數據，并構建COX臨床病理參數回歸模型。其中單因素分析結果顯示，NEK2基因表達量、腫瘤類型與MPM患者預后顯著相關（Plt;0.05）；將NEK2基因表達量和腫瘤類型納入多因素回歸分析發現，NEK2基因表達水平與腫瘤類型均是影響MPM患者預后的獨立因素（Plt;0.05），與肉瘤型MPM患者相比，上皮樣型的MPM患者預后較好（HRlt;1.0）。見表2。

2.6 在MPM中NEK2基因表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

在TIMER 2.0 （tumor immune estimation resource）數據庫中筆者對MPM患者的NEK2基因表達水平的免疫細胞浸潤分析結果得出，MPM樣本中的NEK2基因表達水平與B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞的免疫浸潤水平具有顯著正相關性（Plt;0.05）。見圖4。

2.7 NEK2基因在MPM中的ROC曲線

如圖5所示，NEK2基因在TCGA數據庫MPM數據集的ROC曲線中，一年、三年和五年AUC分別為0.793、0.822和0.894（AUCgt;0.75），具有較好的臨床診斷意義。

2.8 基因富集分析

從TCGA數據庫中對NEK2基因的GSEA分析結果表明，NEK2基因高表達組在細胞周期、卵母細胞減數分裂、DNA復制、mRNA監測途徑、真核生物核糖體生物合成、核質轉運、泛素化介導蛋白質水解、剪接體、內吞作用、范可尼貧血通路顯著富集。見圖6。

2.9 驗證NEK2 mRNA在MPM組織與非MPM胸膜組織的表達差異

RT-qPCR實驗結果表明，NEK2基因mRNA在12例來自楚雄彝族自治州人民醫院病理科MPM組織樣本中的表達水平顯著高于6例非MPM胸膜組織（Plt;0.01）。見圖7。

3 討論

MPM起源于漿膜層的間皮細胞，胸膜是其最常見的發生部位，占所有病例的70%～80%。在導致MPM的諸多病因中，石棉纖維一旦被吸入肺部并穿過胸膜間隙，可引發炎癥級聯反應、巨噬細胞相關吞噬作用，釋放活性氧因子導致間皮細胞染色體和有絲分裂異常，且石棉纖維極難被機體降解［9］。MPM通常表現為不明原因的胸腔積液，并伴有胸壁疼痛、胸膜增厚，很難與其他肺部腫瘤相鑒別，胸腔鏡活檢是診斷MPM的金標準［10］。當前由于缺乏特異診斷MPM的腫瘤標志物，MPM患者確診時常常處于晚期，且尚無行之有效的臨床治療方案，預后極差，故MPM發病率約等于病死率［11］。NEK家族共有11位成員，其中NEK2在人源有NEK2A、NEK2B和NEK2C三種剪接亞型，定位于中心體，控制中心體的分離和兩極紡錘體的形成［12］。NEK2在包括肺癌［13］、肝細胞癌［14］、胃癌［15］、結直腸癌［16］、胰腺癌［17］、乳腺癌［18］、前列腺癌［19］在內的多種腫瘤中高表達，而在MPM中尚無文獻報道。

本研究利用TCGA數據庫探索NEK2基因在MPM中的表達情況及預后意義。由于MPM樣本稀少且缺乏正常對照樣本，故參照正常肺部組織NEK2基因表達情況，發現NEK2基因在MPM樣本中顯著高表達；NEK2基因表達水平與MPM的臨床病理參數相關性分析結果表明，NEK2基因高表達促進MPM淋巴結轉移；其次，NEK2的OS曲線、DFS曲線以及COX單因素和多因素分析均說明NEK2是影響MPM患者預后的獨立風險因素；另外，NEK2基因表達量與MPM中B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈顯著正相關，這表明NEK2可能在MPM中促進腫瘤微環境的免疫活性。已有研究報道NEK2基因表達上調可能導致胃癌免疫周期中免疫細胞浸潤減少，免疫活性減弱［15］；ROC曲線分析提示，NEK2基因在MPM診斷水平具有較好的特異性和靈敏度。然而，目前尚無研究報道NEK2基因通過何種信號通路在MPM中發揮作用。因此，我們通過對表達差異的基因進行GSEA富集分析發現，NEK2基因可能通過細胞周期、DNA復制、剪接體、mRNA監測等信號通路影響MPM的生物學功能。

在細胞周期中，NEK2基因在G1期的含量最低，在G2晚期表達量達到峰值，啟動G2/M期時中心體的分離，NEK2過表達可導致染色體遺傳物質的錯亂，誘導腫瘤的發生，這與MPM中NEK2在細胞周期、卵母細胞減數分裂和DNA復制的基因富集結果一致；NEK2還與多種腫瘤的侵襲、遷移、凋亡以及抗腫瘤藥物的敏感度和耐藥性有關［20］。NEK2抑癌效應的體內外研究已在一些腫瘤類型中被證實［21］，以NEK2為靶向的抗腫瘤治療具有廣大前景，但NEK2在腫瘤中的作用機制仍需被進一步闡明。

綜上所述，NEK2在MPM組織中的表達明顯高于非瘤胸膜組織，并且與患者預后顯著相關。NEK2的作用機制可能與細胞周期調控有關，也可能調控MPM的免疫微環境，具體機制仍需進一步闡明。揭示NEK2基因在MPM中的表達及其對預后的影響，有利于后續開展NEK2基因在MPM發生發展中的機制研究，對完善MPM的臨床診斷與預后評估具有深遠影響。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-10-08 修回日期：2023-12-12）

（編輯：黃研研 梁明佩）

基金項目： 國家自然科學基金（82160516）；云南省應用基礎研究專項面上項目（202201AT070004，202301AT070023）；云南省地方本科高校基礎研究聯合專項面上項目（202101BA070001-226）；云南省地方本科高校基礎研究聯合專項青年項目（202101BA070001-282）；云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室開放課題（AG2022003，AP2022006）

第一作者簡介： 李錦松，男，醫學學士，在讀碩士研究生，研究方向：病理學與病理生理學。E-mail：skyelijah@qq.com

通信作者： 熊偉。E-mail：xiongwei@dali.edu.cn

［本文引用格式］ 李錦松，李彬，劉如愛，等.基于TCGA數據分析NEK2基因在惡性胸膜間皮瘤中的表達及預后意義［J］.右江醫學，2024，52（2）：103-111.