雷公藤紅素聯(lián)合米托蒽醌對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

李雨晨，牟忠顏，劉璽玉，王洪波，呂劍濤

（1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005；2.煙臺市中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺 264100；3.濱州醫(yī)學院藥學院，山東 煙臺 264003；4.濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院，山東 煙臺 264100）

與癌癥相關(guān)的死亡問題一直是全球健康關(guān)注的一個主要問題，當前，癌癥死亡仍是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因［1］，而肝細胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一［2］。HCC患者確診通常都在晚期，腫瘤表現(xiàn)為肝內(nèi)或遠處器官轉(zhuǎn)移，不適合進行手術(shù)治療。化療藥雖是治療腫瘤的主要方式，但是大多數(shù)化療藥物毒副作用強［3］，且耐藥性經(jīng)常發(fā)生，這就需要確定增效劑來提高其生物利用度和治療作用。有研究發(fā)現(xiàn)，一些天然藥用植物的成分毒副作用較少，且高效、靶點多，可以作為傳統(tǒng)或靶向治療的輔助或者替代手段，克服或彌補化療藥物的劣勢。萜類化合物是一類具有治療活性的植物化學物質(zhì)，已被用于治療癌癥、心血管和神經(jīng)退行性疾病［4?5］。雷公藤紅素（Celastrol，Cela）是從一種從衛(wèi)矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）中提取的五環(huán)三萜類單體化合物，其呈現(xiàn)出廣譜、高效的抗腫瘤活性，其抗癌作用已在多種腫瘤的治療中得到證實，如前列腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤和乳腺癌等［6?10］。化療藥物米托蒽醌（Mitoxantrone，MIT）具有很好的治療效果，但其毒副作用和耐藥性成為治療的一大障礙，所以為了克服和彌補這一劣勢，本研究選擇將其與中藥聯(lián)合，篩選發(fā)現(xiàn)Cela與MIT聯(lián)合使用，效果較佳，并能增強MIT的抗腫瘤活性，并減少了MIT的劑量。

1 材料

1.1 藥品與試劑

Cela 標準品（CAS：34157－83－0，純度 ≥ 98%），購于北京索萊寶科技有限公司，用細胞級DMSO 溶解成5 μmol/L 的儲備液，分裝于1 mL EP 管中，?20 ℃避光保存。MIT 標準品（CAS：70476－82－3），用細胞級DMSO 溶解成10 μmol/L 的儲備液，分裝于1 mL EP 管中，?20 ℃避光保存。胎牛血清購于Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基購于Hyclone 公司；胰酶、四甲基偶氮唑鹽試劑（MTT）、Annexin V－FITC/PI 凋亡試劑盒、GAPDH 抗體、二抗山羊抗鼠及山羊抗兔購于上海碧云天生物科技有限公司；抗體Bcl－2、Bax購于Santa Cruz公司。

1.2 細胞

人肝癌HepG2 細胞株，購于中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2 細胞株在含有10% FBS 和1%三抗（青霉素－鏈霉素－慶大霉素混合溶液）的DMEM 培養(yǎng)基里復蘇培養(yǎng)細胞，并將細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

2.2 MTT實驗

取對數(shù)生長期的HepG2 細胞用胰酶進行消化，用DMEM 培養(yǎng)基稀釋，以細胞密度為5 × 103個/孔均勻接種于96 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分別加入不同濃度的Cela 標準品（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L）、MIT 標準品（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L）以及含等體積的完全培養(yǎng)基為對照組，每組設5個復孔分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。棄掉上清液，每孔加入100 μL DMSO，于搖床上振蕩10 min，用酶標儀570 nm 波長進行吸光度（A）檢測，每組實驗進行3次重復。按照公式（1）計算出48 h Cela藥液抑制率為20%的濃度（即IC20），然后繼續(xù)取對數(shù)生長期的HepG2細胞用胰酶進行消化，用DMEM培養(yǎng)基稀釋，以細胞密度為5 × 103個/孔均勻接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h后分別加入不同濃度的MIT（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L）單藥組以及不同濃度的MIT（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L）與48 h Cela的IC20聯(lián)合作用組進行對照，每組設置5 個復孔。各組分別培養(yǎng)24、48 h，后面實驗步驟同上，同樣每組進行3次重復。根據(jù)上述操作，選擇MIT的合適濃度（濃度最低且聯(lián)合效果最好的濃度），然后繼續(xù)取對數(shù)生長期的HepG2細胞用胰酶進行消化，用DMEM 培養(yǎng)基稀釋，以細胞密度為5 × 103個/孔均勻接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。實驗分為對照組、Cela 組（0.6 μmol/L）、MIT 組（0.4 μmol/L）、Cela 聯(lián)合MIT 組（簡稱聯(lián)合組。Cela 0.6 μmol/L+MIT 0.4 μmol/L），每組設置5 個復孔。各組分別培養(yǎng)24、48 h，后面實驗步驟同上，同樣每組進行3 次重復。用金氏公式（公式2）計算Cela 聯(lián)合MIT是否具有協(xié)同作用。

其中，E（A+B）為藥物聯(lián)合的抑制率；EA、EB為單獨藥物組的抑制率。q＞ 1.15 為協(xié)同作用，q=0.85～ 1.15為相加作用，q＜ 0.85為拮抗作用。

2.3 細胞集落實驗

取對數(shù)生長期的HepG2 細胞用胰酶進行消化，用DMEM 培養(yǎng)基稀釋，以細胞密度為2 × 103個/孔均勻接種于6 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分別加入上述MTT 溶液計算出藥液抑制率為20%的濃度，即IC20，0.6 μmol/L Cela、0.4 μmol/L MIT 與聯(lián)合組為實驗組，含等體積的完全培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)3～ 4 d后更換對應藥液進行培養(yǎng)，操作重復3～ 4次后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2～ 3次后，每孔加2 mL 4%多聚甲醛進行固定，30 min后吸棄，再用PBS清洗2～ 3次，每孔加入2 mL結(jié)晶紫進行染色，30 min后吸取結(jié)晶紫進行回收，用PBS清洗殘余的結(jié)晶紫染液，干燥后拍照計數(shù)。實驗重復3次。

2.4 Annexin V?FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡水平

取對數(shù)生長期的HepG2 細胞用胰酶進行消化，用DMEM 培養(yǎng)基稀釋，以細胞密度為2 × 105個/孔/mL 均勻接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入上述MTT 溶液計算出藥液抑制率為20%的濃度，即IC20，0.6 μmol/L Cela、0.4 μmol/L MIT 與聯(lián)合組為實驗組，含等體積的完全培養(yǎng)基為對照組，作用24 h后，將培養(yǎng)液對應置于1 mL EP管中先存留，使用不添加EDTA的胰酶進行消化后吸棄，再將存留的培養(yǎng)液對應于每孔輕輕吹打，再對應置于EP 管中進行離心，棄上清，加PBS重懸后繼續(xù)離心棄上清，重復操作1～ 2次后，每個EP 管加入對應試劑盒要求量的緩沖液，根據(jù)分組設置加入10 μL 的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，Annex V－FITC），10～ 15 min 和避光下加入5 μL 的碘化丙啶（propidium iodide，PI），10～ 15 min 后將EP 管里的液體使用濾膜對應加入96孔板中，使用流式細胞儀進行檢測。

2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白

取對數(shù)生長期的HepG2 細胞用胰酶進行消化，用DMEM 培養(yǎng)基稀釋，以適宜的密度接種于直徑為60 mm 的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞貼壁生長融合度達到75%～ 80%后，分別加入上述MTT溶液計算出藥液抑制率為20%的濃度，即IC20，0.6 μmol/L Cela、0.4 μmol/L MIT與聯(lián)合組為實驗組，含等體積的完全培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)24 h 后，使用裂解液（試劑RIPA 與蛋白酶體抑制劑的混勻液體）在冰上裂解15～ 30 min，使其充分裂解后收集細胞，于4 ℃、13 000 r/min離心10 min 后提取蛋白樣品，BCA 法定量蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣品進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔源性Bax和鼠源性Bcl－2、GAPDH一抗（稀釋度均為1∶1 000），4 ℃冰箱中孵育過夜。洗膜3 次，每次5 min，加入相對應的二抗（稀釋度均為1∶1 000），室溫下于搖床上孵育2 h，再次洗膜3 次 × 5 min，在暗室中加入顯影劑進行顯影。使用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

目的蛋白表達相對強度=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值

2.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間差異的統(tǒng)計學意義采用t檢驗，P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對肝癌HepG2細胞增殖能力的抑制作用

MTT 結(jié)果顯示，不同濃度的Cela（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L）處理HepG2 細胞24 h 后，與對照組比較，除0.2、0.4 μmol/L組外，其余各組的存活率顯著降低（P＜ 0.05）；處理HepG2 細胞48 h 后，與對照組比較，除0.2 μmol/L組外，其余各組的存活率顯著降低（P＜ 0.05）。見圖1。不同濃度的MIT（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L）處理HepG2 細胞24 h 后，與對照組比較，除0.2 μmol/L組外，其余各組的存活率顯著降低（P＜ 0.05）；處理HepG2 細胞48 h 后，與對照組比較，其余各組的存活率顯著降低（P＜ 0.05）。見圖2。從Cela 的MTT 實驗結(jié)果中，選擇48 h 時Cela 的IC20（0.6 μmol/L）與MIT 各個濃度進行24 h 和48 h 的聯(lián)合，選擇聯(lián)合后效果最佳且選出的MIT濃度相對較低，與對照組比較，均具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖3。結(jié)果顯示，MIT 濃度為0.4 μmol/L 時，其濃度最低，聯(lián)合效果最好。見圖4。Cela（0.6 μmol/L）與MIT（0.4 μmol/L）作用HepG2細胞24 h時，q值為2.1；作用HepG2 細胞48 h 時，q值為1.23。結(jié)果表明，Cela 能夠協(xié)同MIT抑制肝癌HepG2細胞增殖。

圖1 不同濃度的Cela作用于HepG2細胞24 h和48 h時細胞存活率比較

圖2 不同濃度的MIT作用于HepG2細胞24 h和48 h時細胞存活率比較

圖3 不同濃度的MIT與48 h時Cela的IC20聯(lián)合作用于HepG2細胞24 h和48 h時細胞存活率比較

圖4 0.6 μmol/L Cela與0.4 μmol/L MIT單獨和聯(lián)合作用于HepG2細胞24 h和48 h時細胞存活率比較

3.2 Cela、MIT 單獨及聯(lián)合用藥對肝癌HepG2 細胞集落形成的影響

集落實驗可進一步探究Cela、MIT 單獨及聯(lián)合用藥對肝癌HepG2 細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與對照組比較，Cela 組、MIT 組及聯(lián)合用藥組對應的細胞克隆數(shù)均減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。且聯(lián)合組呈倍數(shù)減少，與各個單藥組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 0.6 μmol/LCela與0.4 μmol/LMIT單獨和聯(lián)合對HepG2細胞的細胞集落形成影響

3.3 Cela、MIT 單獨及聯(lián)合用藥促進肝癌HepG2 細胞凋亡

流式細胞術(shù)實驗研究Cela、MIT 單獨及聯(lián)合用藥對肝癌HepG2 細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，對照組、Cela 組、MIT 組及聯(lián)合用藥組的凋亡率分別為1.56%、16.7%、19.57%、30.17%，給藥組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；且聯(lián)合組與各單藥組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖6。

圖6 0.6 μmol/L Cela與0.4 μmol/L MIT單獨和聯(lián)合對HepG2細胞凋亡的影響

3.4 Cela、MIT 單獨及聯(lián)合用藥對肝癌HepG2 細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Bcl－2、Bax蛋白是與細胞凋亡相關(guān)的兩個蛋白，為了進一步探索Cela 與MIT 是否通過激活這兩個蛋白發(fā)揮促凋亡作用，本研究通過Western blot分析其對凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2、Bax的表達情況，結(jié)果見圖7。與未經(jīng)處理的對照組相比，Cela與MIT聯(lián)合用藥，能激活Bcl－2、Bax蛋白的表達，抗凋亡蛋白Bcl－2的表達水平明顯下調(diào)（P＜ 0.05），促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯上調(diào)（P＜ 0.05）。Bcl－2/Bax比值決定著細胞凋亡的走向，其比值上調(diào)，抑制細胞凋亡；比值下調(diào)，促進細胞凋亡。本實驗中Bcl－2/Bax比值下調(diào)，表明其可促進肝癌細胞的凋亡，且聯(lián)合給藥組比單獨給藥組結(jié)果更為顯著（P＜ 0.05）。

圖7 0.6 μmol/L Cela與0.4 μmol/L MIT單獨和聯(lián)合對HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

4 討論

從天然資源中尋找新的抗腫瘤藥物是癌癥預防和治療的重要途徑之一，其與化療藥物聯(lián)合使用降低化療藥物的毒副作用和耐藥性也是近年來的研究熱點。Cela 是一種從中藥雷公藤的根皮中提取的活性化合物，與MIT 聯(lián)合使用，在治療肝癌方面，具有較好的協(xié)同作用，這一點首先在金氏公式中也得到了驗證，表明二者聯(lián)合具有協(xié)同作用。單獨使用兩者均可以抑制肝癌細胞的增殖，促進肝癌細胞的凋亡，但是兩者聯(lián)合使用，在抑制增殖和促進凋亡方面差異具有統(tǒng)計學意義，對相關(guān)凋亡蛋白的表達所顯示出來的趨勢差異具有統(tǒng)計學意義。

趨化因子受體CXCR4 是趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子－1（CXCL12）的特異受體，CXCR4 及其配體在許多惡性腫瘤的腫瘤進展、血管生成、轉(zhuǎn)移和生存中起著關(guān)鍵作用［11］。此外，炎癥、肝纖維化進展、HCC 發(fā)展、肝轉(zhuǎn)移等肝臟疾病的發(fā)病機制也與CXCR4 的表達密切相關(guān)［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4 靶向途徑可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境改善肝纖維化進程，促進索拉非尼在HCC中的治療效果［13?14］。因此，阻斷的CXCR4 信號通路在理論上可以用于癌癥治療和HCC治療。CHAN等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Cela 在體內(nèi)抑制CXCR4 表達以及抑制肝癌腫瘤生長的潛在治療作用。與之前的報道一致，該研究進一步證明了Cela在體外和體內(nèi)有誘導肝癌細胞凋亡和抑制生長的能力。

YANG［16］研究結(jié)果表明，Cela 是一種天然的蛋白酶體抑制劑，在癌癥預防和治療方面具有很大的潛力。Cela 以腫瘤細胞蛋白酶體為靶點，能夠在體內(nèi)抑制人類腫瘤生長，這一事實有力地支持了使用蛋白酶體抑制劑作為新型抗癌藥物的概念證明［17?18］。進一步的研究應從如何使用Cela，或設計、合成和評估更強的、選擇性的Cela類似物下手。

綜上，雷公藤紅素和米托蒽醌聯(lián)合使用，可以減少化療藥物米托蒽醌的劑量，降低其毒副作用和長期使用化療藥物所帶來的耐藥性，并且本研究首次提出使用雷公藤紅素和米托蒽醌聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，并且進一步在實驗中得到驗證，證明兩者聯(lián)合具有抑制增長、促進凋亡的作用，且抑制增殖的作用可能與誘導凋亡有關(guān)，分子機制有待進一步研究。