羧基化多壁碳納米管分散固相萃?。厮臉O桿氣質聯用法測定茶葉中16種農藥殘留量

林金俗，榮杰峰，張松艷，樂有東，龔慧婷，張志勇，佘紫文

1.福建八馬茶業有限公司，福建 泉州362000；2.泉州海關綜合技術服務中心，福建 泉州362000

茶葉是一種重要的飲料產品，目前我國是世界上最大的茶葉生產國和茶葉消費國，為保障茶葉的產量和質量，常規生產中多使用噴施農藥的手段進行病蟲害的防治，從而導致茶葉中存在農藥殘留的可能。對農藥制定最大殘留限量，是加強農藥殘留風險管理的重要技術手段，也是世界各國的通行做法。我國最新版《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中對茶葉中農藥的殘留限量指標已達到106項，其中烯蟲乙酯、烯蟲炔酯等17種農藥殘留尚未規定檢測方法或參考方法[1]。GB 2763—2021推薦的氣相色譜分離的檢測方法標準中，樂殺螨[2]、丙酯殺螨醇[3]、滅草環[3]、抑草蓬[3]、百菌清[4]、氯酞酸甲酯[5]指定的是參考果蔬的氣質聯用檢測標準方法，毒蟲畏[6]、茚草酮[7]指定的是參考糧谷的氣質聯用檢測標準方法，巴毒磷[8]采用氣相色譜法，蟲螨腈[9]采用氣質聯用法，烯蟲乙酯、烯蟲炔酯、草枯醚、氟除草醚、格螨酯和環螨酯6種農藥目前尚無茶葉中的檢測方法；該16種農藥中僅百菌清和蟲螨腈為茶園登記用藥，其余14種農藥尚未在我國取得登記，為GB 2763—2021新增農藥品種。以上16種農藥的方法標準和文獻方法相對繁雜，使用儀器設備多，不便于檢測人員的使用，目前國內外關于茶葉中該16種農藥的同時檢測方法尚未見報道。

與單四極桿氣質聯用儀相比，氣相色譜－三重四極桿質譜聯用儀（Gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）因 可獲得更豐富的離子碎片信息而擁有更高的靈敏度、更強的抗干擾能力和更強的定性能力，目前已廣泛應用于茶葉[10-15]、糧谷[16-17]、動物源性食品[18]等基質樣品中目標化合物的分析檢測。

本研究選擇以上16種農藥為研究對象，以羧基化多壁碳納米管（Carboxylated multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs-COOH）為主要凈化材料，結合GC-MS/MS技術，建立了一種通用性強、選擇性好、靈敏度高的快速測定茶葉中16種農藥殘留的GC-MS/MS方法，為相關方法的修訂完善提供有意義的借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Thermo 1300-TSQ9000三重四極桿氣質聯用儀（美國賽默飛世爾科技）：配備電子轟擊源（EI）。

無水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉、乙腈、丙酮和正己烷均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；乙酸乙酯（色譜純），購于美國TEDIA公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，40～60μm）、石墨化碳黑（GCB，40～120μm）和十八烷基鍵合硅膠（C18，40～60μm）購于上海安譜試驗科技股份有限公司，羧基化多壁碳納米管（長度10～30μm，外徑10～20 nm，內徑5～10 nm，純度＞95%，比表面積＞200 m2/g）購于北京德科島金科技有限公司；標準物質從壇墨質檢科技股份有限公司購得[11-12]。

標準溶液：首先用乙酸乙酯配制一定濃度的混合標準中間溶液，再根據需要用乙酸乙酯和空白樣品提取液稀釋得系列標準工作溶液和基質匹配標準工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取2 g茶葉試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL飽和食鹽水，渦旋混勻后靜置30 min；隨后加入10 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩提取5 min；4 000 r/min離心3 min。準確吸取0.9 mL茶葉提取液于2 mL聚丙烯離心管中，加入25 mg PSA、50 mg MWCNTs-COOH、150 mg MgSO4和0.1 mL甲苯；渦旋混合1 min，取上清液過0.22μm有機濾膜，用于測定[19-20]。

1.2.2 色譜條件

進樣口溫度：280℃；不分流進樣，進樣量：1μL；恒流模式，流量為1.0 mL/min；TG-5SILMS毛細管色譜柱，規格：30 m×0.25 mm×0.25μm；柱箱升溫程序：70℃（0 min），以25℃/min升溫至240℃（0 min）；最后以10℃/min升溫至310℃（2 min）[19-20]。

1.2.3 質譜條件

電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：300℃；傳輸線溫度：280℃；多反應監測（SRM Timed）模式：16種農藥的質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

在合適的質量數范圍內，分別對10.0 mg/L的16種農藥標準溶液進行全掃描；選擇質量數較大并且響應較高的離子進行二級碎裂，采用Auto SRM軟件對二級碎裂碰撞電壓進行優化。16種農藥定量離子對、定性離子對及碰撞能量見表1。

表1 16種農藥的保留時間、定量離子對、定性離子對和碰撞能量

2.2 前處理方法優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

根據待測農藥的極性和溶解程度，試驗選擇乙腈、正己烷-丙酮（7∶3）和乙酸乙酯為提取溶劑，將添加有20μg/kg 16種農藥的全發酵（紅茶）、半發酵（烏龍茶）、不發酵（綠茶）茶按照“1.2.1”進行提取凈化后上機檢測，使用乙腈提取時進行溶劑置換后上機，用溶劑標準工作曲線進行校正，每種樣品平行處理3次。3種提取溶劑對16種農藥均可獲得80%以上的回收率，但采用乙腈為提取溶劑時需要進行溶劑置換，氮吹等過程可能導致目標物質的損失且過程繁雜；使用正己烷-丙酮（7∶3）提取時提取液的顏色較深，提取的色素等共提取雜質較多將不利于后續凈化，所以，為獲得更好的方法準確性，同時考慮操作更加便捷，最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。圖1為不同茶類在乙酸乙酯為提取溶劑時16種農藥殘留的提取回收率，不同茶類樣品中16種農藥均獲得90%以上提取回收率，其中巴毒磷、抑草蓬及樂茶螨的回收率較高，超過200%。

圖1 乙酸乙酯為提取溶劑時不同茶類中16種農藥的提取回收率

2.2.2 甲苯用量的選擇

試驗發現，具有平面結構的百菌清容易被MWCNTs-COOH吸附，為了獲得準確的檢測結果，在凈化前向提取溶液中加入一定量的甲苯再進行凈化[11-12]，被吸附的百菌清可以解析出來，而其他農藥受影響的程度較小?？疾炝思妆接昧浚?.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL）對百菌清凈化回收率的影響。結果顯示，隨著甲苯用量的增加，百菌清的凈化回收率呈增大趨勢，當加入量為0.10 mL時，百菌清的凈化回收率即可恢復至100%左右，繼續增大甲苯用量，凈化回收率變化不明顯，但方法的檢測限將受到影響，所以最終選擇甲苯用量為0.10 mL。

2.2.3 吸附劑種類的選擇

試驗考察了50 mg PSA、C18、GCB、MWCNTs-COOH等4種凈化吸附劑對烏龍茶提取液中色素的去除效果。結果顯示，PSA和C18對色素的吸附能力較差，凈化后溶液顏色變化較小仍呈墨綠色，經GCB吸附劑凈化后呈黃綠色，經MWCNTs-COOH凈化后烏龍茶提取液呈淺黃綠色。試驗結果表明MWCNTs-COOH對色素的凈化效果最好；PSA對色素的去除能力較弱，但能有效去除茶多酚、兒茶素類和糖類物質。茶葉基質比較復雜，不同類別（全發酵、半發酵和不發酵）的茶類基質區別較大，所以使用分散固相萃取凈化時需要考慮兩種或多種吸附凈化劑，以更有效除去提取液中的色素、茶多酚、兒茶素和糖類等雜質成分，因此，本研究選擇MWCNTs-COOH和PSA為凈化吸附劑。

2.2.4 吸附劑用量的選擇

為獲得較好的樣品凈化效果，以目標物回收率為考察依據對吸附劑用量進行考察。以加標水平20μg/kg的烏龍茶為基質，按“1.2.1”方法前處理，比較了不同吸附劑組合的凈化效果及其對目標物回收率的影響，吸附劑組合加入MgSO4除水。圖2為不同吸附劑組合凈化后16種農藥的回收率情況。結果顯示，PSA凈化后目標物回收率變化較??；隨MWCNTs-COOH的加入，大部分目標物回收率呈一定的下降趨勢；其中巴毒磷、抑草蓬和樂殺螨的回收率在MWCNTs-COOH的凈化作用下有較大程度的下降；但在MWCNTs-COOH的用量達到20 mg以上后，隨著MWCNTs-COOH用量繼續加大回收率變化變緩，部分農藥回收率仍然較高，說明基質效應仍然明顯。當MWCNTs-COOH用量為50 mg時，烏龍茶提取液顏色為淺黃綠色，紅茶和綠茶的提取液接近無色，最終結合色素清除效果、回收率和經濟效應，選擇25 mg PSA+50 mg MWCNTs-COOH+150 mg MgSO4為本方法的吸附劑組合用量。

圖2 不同吸附劑組合對加標空白樣品提取回收率的影響

2.3 基質效應

基質效應（ME）在氣相系統中主要表現為“基質誘導色譜響應增強現象”，即基質增強效應；通過合適的凈化方法和優化進樣方式等手段可以減小氣相系統在檢測過程中出現的基質效應,但無法將其徹底消除[21-22]。本研究采用公式：基質效應（ME）=[（基質匹配校準曲線斜率／純溶劑標準曲線率）－1]×100%對基質效應進行評估，中等程度以上的基質效應須采取措施補償[23]。16種農藥在紅茶、綠茶和烏龍茶中的基質效應如圖3所示，結果表明，百菌清、氯酞酸甲酯、格螨酯、環螨酯、烯蟲乙酯和丙酯殺螨醇在3種茶葉中為弱基質效應；其余10種農藥在3種基質中基質效應為中等程度以上，特別是巴毒磷、抑草蓬、樂殺螨3種茶葉的基質效應較強，因通過凈化的手段無法完全克服所有基質的基質效應，為了提高檢測方法的準確性，本研究采用基質匹配校準的方法進行基質效應的補償。

圖3 16種農藥在不同茶葉基質中的基質效應

2.4 方法學評價

2.4.1 線性范圍、相關系數和方法檢測限

按照研究建立的方法處理得空白基質溶液，配制基質標準工作溶液，按“1.2”的色譜質譜條件進行檢測，得到線性方程和相關系數，以S/N=10確定方法定量限（LOQ），相關數據見表2（線性方程為烏龍茶基質中獲得）。結果顯示，16種農藥的基質標準工作液在各自范圍內均呈良好的線性關系，方法定量限為0.5～10.0μg/kg，16種化合物的定量限均小于等于GB 2763—2021中限量要求。

表2 16種農藥的回歸方程、相關系數、線性范圍和定量限

2.4.2 回收率和精密度

分別對紅茶、綠茶和烏龍茶空白樣品進行了不同濃度的加標回收試驗，樣品添加混合標準溶液后，振蕩混勻并靜置1 h，以便添加的農藥能被樣品充分吸收，按照“1.2”方法進行前處理和儀器測定，平行處理6次。16種農藥在不同茶葉基質中的添加濃度及平均回收率見表3，紅茶、綠茶及烏龍茶空白樣品在4個水平加標回收試驗中的平均回收率為71.2%～128.2%，相對標準偏差（n=6）為2.3%～9.2%。

表3 不同茶葉中16種農藥4個水平添加量的平均加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.4.3 實際樣品檢測

用本方法對福建省泉州市范圍內采集的50份樣品（其中紅茶10份、綠茶10份、烏龍茶30份）進行檢測，其中蟲螨腈檢出5項次，檢測值為0.15～0.58 mg/kg；百菌清檢出3項次，檢測值0.04 5～0.13 mg/kg。檢測值均遠低于GB 2763—2021限量要求，說明茶葉質量安全整體情況相對良好。

3 小結與討論

本研究建立了茶葉中16種農藥殘留量的快速檢測分析方法，茶葉樣品經乙酸乙酯提取，提取液用MWCNTs-COOH和PSA凈化，經三重四極桿氣質聯用儀測定，基質匹配外標法定量。建立的方法簡單、快速、靈敏度高、準確度好，能滿足茶葉中相關農藥殘留的檢測要求。