水楊酸對鐵觀音茶樹幼苗生理特性及茶氨酸代謝的影響

陳育才

福建省南安市豐州鎮鄉村振興服務中心，福建 泉州362333

茶氨酸是茶樹的特征性氨基酸，是茶樹體內最重要的次級代謝產物之一，具有抗氧化、增強機體免疫、松弛神經緊張等生理活性作用[1-2]，在食品和醫藥領域有著廣泛應用[3-4]。

水楊酸是一種普遍存在于植物體內的小分子酚類化合物，可調節植物的各種代謝途徑[5-6]，外源水楊酸提高植物抗性的研究已經取得一定進展[7-9]。董磊等[10]研究表明，外源水楊酸能通過提高葉綠素含量和過氧化物酶（POD）活性等方式有效緩解高溫脅迫對金花菜的生理影響。在淹水脅迫下，外源水楊酸可提高活性氧清除系統中的超氧化物歧化酶（SOD）和POD的活性，提高可溶性糖、可溶性蛋白質的含量，降低電解質滲漏率和丙二醛（MDA）含量，從而增強辣椒幼苗耐淹水脅迫的能力[11]；在干旱脅迫下，外源水楊酸可有效改善鳳仙花的生長發育，保護光合色素，提高抗氧化酶活性，上調P5CS、P5CR基因表達及促進脯氨酸合成，從而降低干旱脅迫導致的脂質過氧化和氧化損傷[12]；外源水楊酸能顯著緩解干旱脅迫下大豆凈光合速率、氣孔導度、實際光合效率、用于代謝的能量、氮代謝關鍵酶活性和抗氧化酶活性的下降，降低干旱脅迫下用于米勒反應和熱耗散的能量，減少葉片過氧化氫含量，緩解干旱脅迫下的光抑制，提高大豆對干旱脅迫的抗性[13]；水楊酸浸種對鹽脅迫下醉馬草種子萌發和幼苗生長均有促進作用[14]；水稻在受到水楊酸誘導后，激活了水稻體內的多種防衛反應、促進了水稻的病程相關基因的表達，組蛋白乙酰化修飾水平提高，從而使水稻幼苗稻瘟病抗性提高，即產生了誘導抗性[15]。

目前，很多學者主要集中研究茶樹栽培方式、外源氮肥、微量元素等方面的調節對茶氨酸代謝的影響[16-17]，而使用外源水楊酸調節茶氨酸代謝的研究尚未見報道。本研究以適制烏龍茶品種鐵觀音幼苗為試材，采用不同濃度的水楊酸對2年生盆栽幼苗進行葉面噴施，分析水楊酸對茶樹光合性能、抗氧化特性、茶氨酸代謝途徑相關酶基因表達的影響，從而為茶樹高質量栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2年生烏龍茶品種鐵觀音幼苗為試驗材料，試驗在安溪縣茶葉科學研究所生產基地內進行。茶樹幼苗種植于花盆中，生長健壯，地徑1.1 cm左右，植株高85 cm左右，每盆種植2株，每盆裝土4.5 kg；預培養1個月后，選擇長勢相似的幼苗作為試驗材料。

1.2 試驗設計

于2019年4—5月對茶苗葉面噴施水楊酸，設置4個噴施濃度：1.0 mmol/L（處理1）、2.0 mmol/L（處理2）、3.0 mmol/L（處理3）和4.0 mmol/L（處理4），以噴施蒸餾水為對照（CK），共5個處理，隨機區組排列，3次重復，各處理間距離30 cm。葉面噴施于上午9：00前進行，噴施適度為所有葉片滴液，同時噴施等量蒸餾水作為對照處理；每隔1周噴施1次，共噴施4次；試驗期間為防止自然降水影響，設置適當避雨設施。試驗期滿，分別取樣各處理與對照植株的同方向、同節位枝條上的根頸部以上第三片成熟葉片，進行相關指標測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 生化檢測

參照《茶游離氨基酸總量的測定》（GB/T 8314—2013）測定茶氨酸含量，比色法測定MDA含量，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量，比色法測定POD活性，分光光度法測定葉綠素含量，水浴浸提法測定脯氨酸含量，蒽酮比色法測定可溶性糖含量[18]。

1.3.2 茶樹茶氨酸代謝途徑相關酶基因的表達

采用RNA提取試劑盒提取RNA；以茶樹葉片總RNA為模板，采用Perfect Real Time合成cDNA；以cDNA為模板，熒光定量分析采用SYBR Premix Ex Taq TMII試劑盒，引物由上海生工公司合成，引物系列設計見表1。

表1 相關酶基因引物序列

選擇茶樹GADPH作為內參基因，每個對照基因樣品和內參基因樣品都設置3個重復及1個對照（陰性），觀察溶解曲線及擴增曲線，相對表達量計算采用2-ΔΔCT法。

1.4 數據分析

進行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 外源水楊酸處理對鐵觀音幼苗光合性能的影響

不同濃度的外源水楊酸處理對鐵觀音幼苗葉綠素、可溶性糖和蛋白質含量均有不同程度影響。由表2可見，鐵觀音幼苗的葉綠素含量隨著外源水楊酸濃度的提高呈現先增后降的趨勢，在水楊酸濃度為3.0 mmol/L時達到最大值，且與對照差異顯著，比對照增加30.28%；鐵觀音幼苗的蛋白質含量在噴施外源水楊酸后均有提高，其中水楊酸濃度1.0～3.0 mmol/L處理的蛋白質含量顯著高于對照，但處理間差異不顯著；可溶性糖含量當水楊酸

表2 外源水楊酸處理對鐵觀音幼苗光合性能的影響mg/g

濃度3.0 mmol/L時達到最大值，且與對照差異顯著，比對照增加49.74%，水楊酸濃度4.0 mmol/L時可溶性糖含量略微下降，但仍顯著高于對照。

2.2 外源水楊酸處理對鐵觀音幼苗抗氧化特性的影響

POD、MDA和脯氨酸為植物抗氧化特性的主要指標。由表3可見，隨著外源水楊酸濃度的升高，鐵觀音幼苗POD活性表現出先升高后降低的趨勢，水楊酸濃度為3.0 mmol/L時POD活性達到最大值，與對照差異顯著，比對照增加69.29%；MDA含量在水楊酸濃度為2.0～4.0 mmol/L時顯著低于對照，并隨著水楊酸濃度的提高而下降；脯氨酸含量在噴施外源水楊酸后均有不同程度下降，但只有處理3與對照差異顯著。

表3 外源水楊酸處理對鐵觀音幼苗抗氧化特性的影響

2.3 外源水楊酸處理對鐵觀音幼苗茶氨酸含量的影響

茶氨酸是茶樹體內特有的氨基酸，不僅是茶的主要呈味物質，也是其主要功能成分，可以改善人體免疫功能，提高抵抗力等。經外源水楊酸處理后，茶氨酸含量隨著水楊酸濃度的提高出現先升高后降低的現象（圖1）；水楊酸濃度為2.0 mmol/L和3.0 mmol/L時，茶氨酸含量顯著高于對照；水楊酸濃度為4.0 mmol/L時茶氨酸含量降低，且顯著低于對照。由此可見，水楊酸對茶氨酸的生成具有濃度效應，低于3.0 mmol/L時促進茶氨酸生成，高于3.0 mmol/L時則抑制茶氨酸生成。

圖1 水楊酸濃度對鐵觀音幼苗茶氨酸含量的影響

2.4 外源水楊酸處理對鐵觀音幼苗茶氨酸代謝途徑相關酶基因表達的影響

茶氨酸合成代謝途徑基因包括直接參與合成的茶氨酸合成酶基因和茶氨酸水解酶基因，還包括谷氨酸合成相關的基因及茶氨酸轉運相關基因。谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、谷氨酸合成酶（CSGS）和茶氨酸合成酶（TS）是茶氨酸代謝途徑中的關鍵酶。由圖2可見，水楊酸處理的GDH和TS1的基因表達量均高于對照，且隨著水楊酸濃度增加表現出先升高后降低的趨勢；當水楊酸濃度為3.0 mmol/L時GDH和TS1的基因表達量均達到最大值。CSGS基因表達量隨著水楊酸濃度的增加而逐漸降低，當水楊酸濃度為1.0 mmol/L時基因表達量顯著高于對照，當水楊酸濃度為2.0～3.0 mmol/L時基因表達量與對照差異不顯著，當水楊酸濃度為4.0 mmol/L時基因表達量顯著低于對照。

圖2 不同水楊酸濃度處理對CSGS、GDH、TS1表達量的影響

水楊酸處理的GS和TS2的基因表達量均高于對照，且隨著水楊酸濃度增加表現出先升高后降低的趨勢；當水楊酸濃度為2.0 mmol/L、3.0 mmol/L時GS和TS2的基因表達量均顯著高于對照，且當水楊酸濃度為3.0 mmol/L時GS和TS2的基因表達量均達到最高值（圖3）。

圖3 不同水楊酸濃度處理對GS、TS2表達量的影響

3 小結與討論

水楊酸在植物代謝生理中起著重要的作用，能夠促進植物細胞分裂和伸長，降低膜脂過氧化作用，提高植物體內抗氧化酶活性，以緩解環境脅迫對植物造成的傷害[19]。水楊酸可以通過提高植物的抗氧化活性對植物體內的信號通道產生影響[20]。前人研究表明，半夏植株噴施0.5 mmol/L水楊酸后，葉綠素含量和塊莖鮮質量顯著增加，植株MDA含量降低，SOD保護酶活性提高[21]。甜櫻桃采收期噴施0.5 mmol/L水楊酸，果實的色澤、硬度、可溶性固形物、總酚酸含量，以及保護酶活性顯著提高[22]。水楊酸雖能促進細胞的生長，但高濃度的水楊酸處理或內源水楊酸的積累會對細胞生長產生氧化脅迫傷害，表現出抑制作用[23]。本試驗中噴施3.0 mmol/L水楊酸處理的鐵觀音幼苗葉綠素、可溶性糖和蛋白質含量均顯著增加，脯氨酸和MDA含量顯著降低，POD活性顯著提高。而較高濃度的水楊酸明顯抑制鐵觀音幼苗的生長，表現出輕微的毒害作用。這可能是由于葉面噴施水楊酸后，植物體內防御機制被啟動，導致參與防御反應的相關酶活性升高。

水楊酸是植物抗逆的內源信號物，可誘導植物體內某些次生代謝產物的生物合成[24-26]。本研究中噴施3.0 mmol/L水楊酸對茶樹茶氨酸含量的增加具有促進作用，而較高濃度的水楊酸明顯抑制茶氨酸生物生成。

茶氨酸的生物合成也受到茶氨酸合成代謝途徑基因表達的調控[27]。林鄭和等[28]比較茶氨酸含量不同的茶樹種質，發現在高茶氨酸種質中GDH基因表達顯著增強。Wang等[29]發現干旱導致茶氨酸含量降低，其中GS、CSGS等基因表達下降，同時茶氨酸水解酶基因表達水平升高。本研究中，GDH和TS1對茶氨酸合成代謝起到主要作用，適宜濃度的外源水楊酸有利于提高茶氨酸的積累。目前，雖然部分參與茶氨酸合成代謝的關鍵酶基因已被克隆，但對于該代謝途徑的轉錄調控網絡還不清楚；外源信號物對茶氨酸代謝調控機理有待進一步研究。