巴戟天水提物與巴戟天多糖促進C2C12肌管分化作用機制

潘瑞金 姜謐 金麗英 黃濤

(1吉林大學第一醫院心臟外科，吉林 長春 132000；2沈陽醫學院病理學教研室)

骨骼肌在血糖利用方面作用極其重要，人體約70%的糖原儲存由骨骼肌完成，85%以上的糖分是供給骨骼肌轉化成能量和體力的〔1〕。同時人體所有的活動幾乎都是由骨骼肌收縮來完成的，其強弱直接影響人體的行動能力。因此，臨床上糖尿病、肌少癥、肥胖等疾病都與骨骼肌功能缺陷有關，特別是與年齡、疾病相關的肌肉損傷或損失有關〔2〕。巴戟天(Morindae Radix，Morinda officinalis How.)為雙子葉植物藥茜草科植物巴戟天的根〔3〕。《本經》有載巴戟天主大風邪氣，陰痿不起，強筋骨，安五臟，補中增志益氣。巴戟天主要含有蒽醌類、環烯醚萜類、糖類及黃酮類等成分〔4〕。其中巴戟天多糖(MP)具有抗氧化、抗疲勞、免疫調節、抗骨質酥松等藥理作用〔5〕。本研究將巴戟天水提物(MA)和MP作用于小鼠骨骼肌細胞C2C12肌管，旨在探討MA及MP調節骨骼肌分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 紫外分光光度計(WD-9403F)，Bio-Rad成像系統(GelDoc XR+IMAGELAB)，Glomax multi檢測系統(E8944)，萊卡熒光顯微鏡(DM2500)。

1.1.2試藥 巴戟天購自長春中藥大學附屬醫院，C2C12細胞購自American Type Culture Collection (ATCC)，胎牛血清(FBS)，馬血清(HS)及DMEM購于GIBCO公司，MP、D-葡萄糖購自成都普菲德生物技術有限公司，肌球蛋白重鏈(MyHC)、成肌分化抗原(MyoD)、肌細胞生成素(Myogennin)抗體購自Santa Cruz 生物技術有限公司，線粒體轉錄因子(TFAM)抗體購自Cell Signaling生物技術有限公司。細胞葡萄糖攝取測試劑盒購自Cayman Chemical公司。細胞線粒體提取試劑盒購自Thermo Fisher 科技公司。

1.2方法

1.2.1MA制備 稱取實驗所需的20 g巴戟天，加入500 ml蒸餾水并浸泡30 min，大火加熱煮沸小火微沸提取兩次每次1.5 h，真空抽濾，合并兩次濾液，濃縮直至膏狀，冷凍干燥48 h，在研磨至粉狀，4℃冷藏備用。

1.2.2MA中多糖的含量測定 本實驗采用硫酸苯酚法，精確稱取MA粉末10 ml，溶解并定容至100 ml容量瓶中。1 ml供試液與1 ml 5%苯酚溶液混勻后加入5 ml濃硫酸，反應5 min，水浴加熱15 min，冷卻30 min后，紫外分光光度法，490 nm波長下讀取吸光度。并對儀器精密度、實驗重復性及樣品溶液的穩定性進行方法學考察，D-葡萄糖為標準品制備標準曲線。計算MA中多糖的含量。

1.2.3細胞的培養及分化 C2C12細胞采用含有10%FBS的DMEM，37℃，5% CO2培養箱中培養，細胞生長至 80%左右，用含有2% HS的DMEM培養基誘導肌管分化，每天更換培養基，連續誘導5 d至肌管形成后，不同濃度的MA和MP及陽性藥二甲雙胍給藥24 h，細胞收獲后備用。將細胞分成6組，N組正常培養，MA0.5組為MA 0.5 mg/ml給藥組，MA1.0為MA 1.0 mg/ml給藥組，MP1.0組為MP 1.0 mg/ml給藥組，MP2.0組為MP 2.0 mg/ml給藥組，M組為二甲雙胍給藥組。

1.2.4細胞活性檢測 將C2C12細胞接種于96孔板中(103個/孔)，用不同濃度的MA和MP及陽性藥二甲雙胍給藥24 h后，移除培養基，按EZ-cytox細胞活性試劑盒方法，測量OD值，計算細胞活性。

1.2.5Western印跡 C2C12 肌管給藥24 h后，細胞收獲，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離凝膠，80 V電泳分離蛋白，4℃ 120 V轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉3 h。分別一抗、二抗孵育后，于Bio-Rad成像系統下加電化學發光(ECL)顯影液顯影，以β-actin為內參，計算相關蛋白表達水平。

1.2.6C2C12肌管糖攝取量檢測 C2C12肌管給藥24 h后，采用細胞葡萄糖攝取檢測試劑盒方法饑餓培養6 h后，培養基中加入熒光葡萄糖類似物(2-NBDG)100 μl繼續培養4 h后，485/650 nm(激發光/發射光)濾鏡下熒光檢測C2C12肌管2-NBDG的攝取量。

1.2.7C2C12肌管線粒體提取 C2C12肌管給藥24 h后，采用細胞線粒體提取試劑盒方法，收獲的細胞1×磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，加入800 μl試劑A，中速渦旋裂解5 s，加入10 μl試劑B，以高速度渦旋5 s，冰上冷卻5 min，期間每分鐘渦旋1次，5 s/次，加入800 μl混合有1%的蛋白酶抑制劑的試劑C，混合均勻，4℃，750 r/min離心10 min，取上清14 000 r/min離心15 min，再將沉淀加入500 μl試劑C，4℃，14 000 r/min離心5 min，管內沉淀即為線粒體。線粒體蛋白提取后，BAC法測定線粒體蛋白含量。

1.2.8C2C12免疫熒光染色 將C2C12接種于Thermanox塑料蓋片上并誘導肌管分化，C2C12肌管給藥24 h后，用4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100孵育20 min，1×PBS沖洗后，用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育30 min，MyHC抗體4℃孵育過夜。隨后用熒光染料AlexaFluor 488室溫孵育1 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min。最后，200倍鏡下熒光顯微鏡觀察MyHC的表達。

1.3統計學分析 使用ImageJ軟件對圖像進行分析，并用GraphPad分析軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1MA中MP的含量測定 以D-葡萄糖標準溶液制備標準曲線(圖1)，所得線性方程為y=10.175x+0.005，R=0.999 6，實驗結果表明在0.02～0.10 mg/ml濃度范圍內，線性關系良好。平行制備MA溶液6份，測定MA溶液中多糖平均含量為5.23%，RSD值為1.56%，本實驗重復性良好。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2MA與MP對C2C12細胞活性的影響 MA 0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/ml處理C2C12細胞活性分別為(99.89±1.67)%、(103.91±2.32)%、(107.58±2.21)%、(113.74±3.43)%、(117.45±2.27)%、(90.80±2.14)%；MP 0.00、0.01、0.05、0.10、0.20、0.40處理C2C12細胞活性分別為：(100.11±1.48)%、(103.25±2.95)%、(107.57±2.78)%、(112.18±3.65)%、(117.29±1.01)%、(87.02±4.46)%。0.10、0.50、1.00 mg/ml的MA可以顯著增強C2C12細胞活性(P<0.05)；2.0 mg/ml的MA可以顯著抑制C2C12細胞活性(P<0.05)。0.05、0.10、0.20 mg/ml 的MP可以顯著增強C2C12細胞活性(P<0.05)；0.40 mg/ml的MA可以顯著抑制C2C12細胞活性(P<0.05)。通過C2C12細胞活性測試結果，本實驗選擇0.50、1.00 mg/ml為后續實驗MA給藥濃度，0.10、0.20 mg/ml為MP后續實驗給藥濃度。

2.3MA與MP對C2C12肌管糖攝取的調節作用 MA 1.0組、MP 2.0組、M組C2C12肌管的葡萄糖攝取能力及GLUT4蛋白表達與N組相比存在顯著性差異(P>0.05)。見表1、圖2。

表1 各組肌管葡萄糖攝取能力及GLUT4、MyHC、MyoD、Myogenin蛋白表達比較

圖2 各組GLUT4、MyHC、MyoD、Myogenin蛋白表達比較

2.4MA與MP對C2C12肌管分化的調節作用 MA1.0組、MP1.0組、MP2.0組C2C12肌管中MyHC蛋白表達水平與N組相比存在顯著差異(P>0.05)。見表1。同時對C2C12肌管中MyHC的表達進行熒光染色，結果如圖3所示，MA與MP能夠有效增加肌管分化長度和MyHC表達的熒光亮度。MA1.0組、MP2.0組的C2C12肌管中MyoD、Myogenin蛋白表達水平與N組相比存在顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖3 C2C12肌管MyHC蛋白免疫熒光染色(×200)

2.5MQ與MP對C2C12肌管線粒體功能的調節作用 與N組相比，其余各組C2C12肌管線粒體蛋白含量顯著增加，MA1.0組與MP2.0組中C2C12肌管線粒體蛋白的TFAM表達水平較N組差異顯著(均P<0.05)。見表1、圖4。

圖4 TFAM蛋白表達

3 討 論

巴戟天為補腎要劑，能治五勞七傷，強陰益精。氣味辛溫，又能祛風除濕，故可用于腰膝疼痛，風氣腳氣水腫等癥。《千金要方》中將巴戟天配伍淮牛膝，主要以巴戟天補腎壯陽、強筋骨，以淮牛膝補肝腎、強筋骨，以酒助藥力。用于肝腎不足，腎陽虛衰，陽痿，腰膝酸軟，下肢無力。多糖是中藥中廣泛存在的成分，有研究證明巴戟天能夠降低高血糖小鼠的血糖并提高高血糖小鼠的抗氧化能力〔6〕。研究表明，MP能促進成骨細胞的分化，促進細胞增殖，具有抗骨質疏松的作用〔7〕。

肌管是一種高度代謝活性的細胞類型，線粒體生物發生可以響應代謝轉移，如肌管的發生和分化所需能量的增加及肌管中的糖代謝能力增強〔8〕。線粒體生物發生是由一系列轉錄因子調控的，TFAM就是研究線粒體發生調控機制的重要靶點之一。TFAM通過與線粒體DNA (mtDNA) 輕鏈和重鏈的啟動子區域特異性的結合，從而激活mtDNA的轉錄〔9〕。本實驗結果證明，1.0 mg/ml MA與0.2 mg/ml MP可以通過調節TFAM蛋白表達有效提高線粒體生物發生。線粒體生物發生為C2C12肌管的分化提供能量，成肌細胞向肌管分化是由成肌調節因子MRFs家族調控的，如MyoD、MRF4、Myf5和Myogenin〔10〕。MyHC是肌原纖維粗絲的骨架成分之一。Lin等〔11〕以MyoD、Myogenin及MyHC表達水平來評價C2C12肌管分化狀態。本研究結果證明，1.0 mg/ml MA與0.2 mg/ml MP可以通過調節MyoD、Myogenin及MyHC的表達加強C2C12肌管分化水平。葡萄糖的利用能力是骨骼肌功能的重要評價。GLUT4 是細胞膜上的一種葡萄糖轉運載體，與葡萄糖攝取能力呈正相關。研究表明GLUT4基因表達障礙可以引起糖耐量減退和胰島素抵抗〔12〕。本研究結果表明，1.0 mg/ml MA與0.2 mg/ml MP可以通過調節GLUT4蛋白表達有效增強C2C12肌管葡萄糖攝取能力。

綜上，巴戟天和MP可通過調節線粒體生物發生促進C2C12 肌管分化及葡萄糖攝取。因此巴戟天及MP可能會通過改善骨骼肌功能缺陷應用于糖尿病、肌少癥、肥胖等疾病，本研究將為巴戟天及MP的臨床應用提供理論基礎及科研依據。