姜黃素調控miR-551b-3p對食管癌EC9706細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

耿錳行 孫玉信

(1河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2河南中醫藥大學第三附屬醫院)

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，化療是臨床上治療食管癌的主要方法之一，但治療效果不佳且患者預后較差，中草藥具有抗炎、抗癌等作用，已有研究表明甘草甜素等中藥提取物可抑制食管癌的發展進程〔1～4〕。姜黃素是姜黃屬植物根莖中的多酚化合物，其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，并可抑制多種腫瘤細胞的生長，研究表明姜黃素通過調節Notch信號誘導食管癌細胞凋亡〔5〕。miR-551b-3p在食管鱗癌細胞中表達水平降低，并可能參與食管鱗癌發生及發展過程〔6〕。但miR-551b-3p是否可作為姜黃素治療食管癌的潛在靶點尚未可知。本研究探究姜黃素調控食管癌細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的機制與miR-551b-3p之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 姜黃素(上海一研生物)；正常食管上皮細胞HEEC與食管癌細胞EC9706(美國ATCC)；Lipofectamine2000轉染試劑(上海陽光生物)；miR-NC、miR-551b-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-551b-3p(廣州銳博生物)；Trizol試劑(美國Invitrogen)；反轉錄及qRT-PCR試劑盒均(日本TaKaRa)；CCK-8試劑(上海李記生物)；Transwell小室(北京優尼康生物)；Matrigel基質膠、凋亡檢測試劑(北京索萊寶)；兔抗人G1/S特異性周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、p21、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體(美國CST)公司；二抗(北京中杉金橋生物)。

1.2實驗分組 EC9706細胞分別加入含有不同濃度(5、10、20 μmol/L)姜黃素的培養液中培養24 h〔7〕，設置低、中、高劑量姜黃素組。空白的EC9706細胞設為對照組。轉染miR-NC、miR-551b-3p mimics的EC9706細胞，設為miR-NC組、miR-551b-3p組。anti-miR-NC、anti-miR-551b-3p轉染EC9706細胞后加入含有20 μmol/L姜黃素的培養液中培養24 h，分別記為高劑量姜黃素+anti-miR-NC組、高劑量姜黃素+anti-miR-551b-3p組。

1.3qRT-PCR檢測miR-551b-3p表達 使用RNA抽提試劑盒提取待測細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA，-20℃保存備用。按照qPCR試劑盒的操作說明書要求操作，檢測cDNA中miR-551b-3p的相對表達量。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖 收集各組細胞，調整至適當密度2×105個/ml，按照100 μl/孔的劑量接種96孔板。在細胞培養箱中培養4 h后，取出每孔加入10 μl CCK-8溶液，微微震蕩混勻，繼續培養2 h，在490 nm波長下檢測各組細胞的OD值。

1.5Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 侵襲：Matrigel基質膠在稀釋時，使用無血清培養基。將100 μl稀釋液鋪于上室，各組細胞經胰蛋白酶消化后采用DMEM培養基重懸(2×105/ml)，按照每孔200 μl的密度加入上室，取含胎牛血清DMEM培養基600 μl加入下室，繼續培養24 h。上室底部朝上，用4%甲醛溶液固定20 min，再使用0.5%的結晶紫溶液染色15 min。遷移：上室不需加入Matrigel基質膠稀釋液，其余同上。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 按照凋亡檢測試劑盒說明書要求操作。具體步驟：用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液洗滌細胞5次，結合緩沖液制備成懸浮液。用5 μl的膜聯蛋白(Annexin)V、碘化丙啶(PI)染色，避光孵育20 min，流式細胞術檢測分析并讀取細胞的凋亡情況。

1.7Western印跡檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、p21、Bax蛋白 細胞使用RIPA、超聲裂解后，12 000 r/min，離心5 min，收集總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)液對蛋白定量。將5倍的上樣緩沖液與蛋白樣品混合，并在沸水中煮沸10 min，進行變性。取變性后的上清上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離蛋白。轉膜儀將蛋白濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉膜后使用封閉液37℃封閉2 h。一抗稀釋液4℃孵育過夜，二抗稀釋液室溫條件下孵育1 h。ECL顯影，曝光。ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.8統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1miR-551b-3p在食管癌EC9706細胞中的表達 與HEEC細胞(1.01±0.04)比較，EC9706細胞中miR-551b-3p的表達水平顯著降低(0.43±0.03，t=12.523，P=0.000)。

2.2姜黃素對食管癌EC9706細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與對照組比較，低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組細胞活力明顯降低，遷移侵襲數顯著下降，凋亡率顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低，p21、Bax蛋白相對表達量顯著升高(均P<0.05)，見圖1、表1、表2、圖2。

表1 姜黃素對食管癌EC9706細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表2 姜黃素對食管癌EC9706細胞增殖、遷移侵襲、凋亡相關蛋白及miR-5516-3p的影響

A：EC9706細胞的遷移侵襲(結晶紫染色，×100)；B：細胞凋亡流式圖圖2 姜黃素對食管癌EC9706細胞遷移侵襲和凋亡的影響

2.3姜黃素對食管癌EC9706細胞中miR-551b-3p的影響 與對照組比較，低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組miR-551b-3p的表達水平升高(P<0.05)，見表2。

2.4過表達miR-551b-3p表達對食管癌EC9706細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-551b-3p組細胞活力明顯受到抑制，遷移侵襲數均顯著下降，凋亡率明顯升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，p21、Bax蛋白相對表達量顯著升高(均P<0.05)，見圖3、表3、圖4。

A：EC9706細胞的遷移侵襲(結晶紫染色，×100)；B：細胞凋亡流式圖圖3 過表達miR-551b-3p表達對食管癌EC9706細胞遷移侵襲和凋亡的影響

表3 過表達miR-551b-3p表達對食管癌EC9706細胞增殖、遷移侵襲和凋亡及相關蛋白的影響

圖4 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的表達

2.5下調miR-551b-3p能逆轉姜黃素對食管癌EC9706細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與高劑量姜黃素+anti-miR-NC組比較，高劑量姜黃素+anti-miR-551b-3p組細胞活力顯著上升，遷移侵襲數均明顯上調，凋亡率顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，見圖5、圖6、表4、表5。

圖5 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的表達

A：EC9706細胞的遷移侵襲(結晶紫染色，×100)；B：細胞凋亡流式圖圖6 下調miR-551b-3p能逆轉姜黃素對食管癌EC9706細胞遷移侵襲和凋亡的影響

表4 下調miR-551b-3p能逆轉姜黃素對食管癌EC9706細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表5 下調miR-551b-3p能逆轉姜黃素對食管癌EC9706細胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的影響

3 討 論

目前食管癌的發病機制尚未完全闡明，臨床主要采用手術切除等方式進行治療，但食管癌具有高度侵襲性與轉移性導致患者治療效果降低，化療等治療方式又具有一定毒副作用，中醫藥在延緩病情與控制復發等方面具有重要作用，既往研究顯示，橙皮素、紫花牡荊素等可促進食管癌細胞凋亡，還可抑制細胞轉移〔8～10〕。中醫藥抗腫瘤作用主要通過多途徑、多靶點而發揮作用，但姜黃素抗食管癌的分子機制尚未闡明。

姜黃素可抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲，其作用機制可能與抑制Hsp90-JAK/STAT3信號通路有關〔11〕。姜黃素可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路從而抑制鼻咽癌細胞增殖及促進細胞凋亡〔12〕。姜黃素對乳腺癌細胞具有增殖、遷移侵襲抑制及凋亡促進作用〔13〕。本研究結果說明，姜黃素對食管癌細胞的增殖呈現抑制作用。細胞增殖相關蛋白CyclinD1、p21在食管癌中能夠通過調控癌細胞的細胞周期進而調節癌細胞的增殖〔14〕。本研究結果進一步證實，姜黃素可通過抑制食管癌細胞增殖而發揮抗癌作用。MMP-2、MMP-9作為基質破壞的標志物，其表達水平的上調預示著細胞外基質的破壞，從而增強癌細胞的轉移能力〔15〕。本研究結果提示，姜黃素可抑制食管癌細胞遷移及侵襲。Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白〔16〕。本研究結果提示，姜黃素可明顯促進食管癌細胞凋亡。

研究表明miR-551b-3p通過靶向CyclinD1而抑制人膽管癌的腫瘤生長，進一步研究發現LncRNA MIAT可通過調控miR-551b-3p/CyclinD1分子軸而促進膽管癌細胞的增殖〔17，18〕。本研究結果與上述實驗結果相一致。抑制miR-551b-3p表達可明顯拮抗姜黃素對食管癌細胞增殖、遷移侵襲及凋亡的治療作用，說明miR-551b-3p在姜黃素的抗食管癌惡化中發揮了關鍵作用。

綜上，姜黃素抑制食管癌細胞增殖、遷移侵襲，促進凋亡。食管癌細胞中miR-551b-3p的表達水平降低，而姜黃素可促進食管癌細胞中miR-551b-3p的表達，抑制miR-551b-3p的表達可拮抗姜黃素對食管癌細胞生物學行為的作用，表明姜黃素抗食管癌的作用與上調miR-551b-3p的表達有關，可為進一步揭示姜黃素治療食管癌的分子機制奠定實驗基礎。