IGF-1和LY294002在大鼠腦缺血再灌注損傷中的相互作用機制

呂威力 邢雪松

(沈陽醫學院 1病理學教研室，遼寧 沈陽 110034；2解剖學教研室)

血管性癡呆(VD)是指由腦出血或者腦缺血等血管疾病，引發的一系列的獲得性認知障礙綜合征〔1～3〕。胰島素樣生長因子(IGF)-1的分子量在7.6 kD，是單鏈多肽分子，可以通過血腦屏障。IGF-1與其受體的結合可激活細胞內磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號轉導通路，通過PI3K激活的Akt促進細胞存活，LY294002作為PI3K/Akt信號通路抑制劑能夠有效抑制IGF-1這種作用〔4～6〕。短暫性的缺血缺氧損傷及缺血再灌注損傷(CIRI)對人和動物的腦海馬神經元有較大損傷，海馬區域與學習和記憶能力關系緊密，所以本實驗建立血管性癡呆大鼠模型采用了兩血管阻斷加硝普鈉降壓法，通過實驗檢測PI3K和β-連環蛋白(catenin)在各組大鼠皮質和海馬組織中的表達及IGF-1和LY294002的干預作用，探討血管性癡呆大鼠內源性PI3K/Akt信號通路和Wnt/β-catenin信號通路分子的改變對缺血神經元協同修復的機制。

1 材料和方法

1.1化學試劑 LY294002和IGF-1(上海碧云天生物技術有限公司)，抗PI3K單克隆抗體(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)，抗β-catenin多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。其他試劑均購于Sigma公司。

1.2實驗動物 健康雄性SD大鼠48只，10～12周齡，體重250～300 g。購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號〔SCXK(遼)2015-0001〕。采取隨機法，將SD大鼠分為假手術組(S組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、腦缺血再灌注+LY294002后處理組(LY組)、腦缺血再灌注+IGF-1后處理組(IGF-1組)，每組12只。

1.3動物模型 采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立大鼠血管性癡呆模型。腹膜內注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)。固定大鼠后，作頸中線切口，逐層分離左、右頸總動脈，按照2.5 mg/kg腹腔注射硝普鈉降低實驗大鼠血壓，動脈夾依次夾閉左右頸總動脈，10 min后打開動脈夾，再灌注10 min，再次夾閉10 min，最后一次打開動脈夾，開始縫合傷口，局部應用抗生素預防切口被感染，飼養環境保持恒溫恒濕。S組僅分離動脈，不阻斷血管，余同手術組。LY組在大鼠缺血再灌注前15 min按照0.3 mg/kg經大鼠尾靜脈注入1 ml LY294002。IGF-1組照14 μg/kg在大鼠缺血再灌注后1 h經尾靜脈注入1 ml IGF-1，S組和I/R組注射1 ml生理鹽水。S組、I/R組、LY組和IGF-1組實驗動物均在術后3 d處死取腦，制備石蠟切片厚約4 μm，進行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大腦皮質組織學形態。

1.4神經行為學評分 神經行為學評分：0分：無神經功能障礙；1分：大鼠前爪不能完全伸展；2分：實驗動物在走路時向側面搖動；3分：行走時，實驗動物身體向兩側傾倒；4分：不能自發行走，有意識喪失。篩除神經評分為0分和4分的實驗動物，為確保每組12只大鼠，實驗過程中隨機補充。

1.5行為學檢測 術后進行2 w穿梭箱訓練。先將實驗大鼠放入穿梭箱中，引導大鼠在箱內自如穿梭，熟悉箱內環境，暗適應10 min后進行后續實驗。訓練開始，首先給予持續聲音刺激5 s，如大鼠不逃至另一端，則給予電擊懲罰，即在穿梭箱底部通有3 mA電流，若大鼠逃至穿梭箱另一側，將不會再受到電擊，未完成穿梭將會被電擊5 s。間隔1 min后再給予聲刺激，開始下一輪訓練。每次穿梭箱訓練為20輪聲、電刺激。大鼠在聽到聲音刺激后能立即完成穿梭動作，這稱為主動回避反應(AAR)。在電刺激后才能完成穿梭動作被稱為被動回避反應(PAR)。如果穿梭動作未完成，則判定為失敗。每次訓練，記錄大鼠AAR和PAR的次數及AAR、PAR比率(AAR%、PAR%)。大鼠的條件性學習記憶能力以最后一次訓練結果為準，統計分析實驗動物最后一次訓練的AAR%、PAR%。

1.6免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟水化，3%過氧化氫室溫避光孵育10 min，抗原修復(微波修復)3 min，正常山羊血清封閉，室溫下孵育20 min，滴加一抗(PI3K稀釋比例1∶1 000，β-catenin稀釋比例1∶200)4℃孵育過夜。生物素化二抗工作液處理，37℃孵育30 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色約3 min。蘇木素復染，分化返藍，中性樹膠封片。

1.7統計學處理 采用 SPSS22.0統計進行t檢驗、單因素方差分析和 SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1行為學評分 S組神經功能評分為0分。與S組相比，I/R組和LY組行為學評分明顯升高〔(2.58±0.07)分、(2.69±0.09)分；P<0.05〕。與I/R組和LY組相比，IGF-1組神經功能評分明顯降低〔(2.26±0.11)分，P<0.05〕。

2.2穿梭箱測試結果 與S組相比，I/R組和LY組的主動和被動回避反應率均顯著下降(P<0.05)，LY組AAR率下降更明顯。IGF-1組AAR率明顯高于I/R組和LY組(P<0.05)。見表1。

表1 各組穿梭箱測試結果及海馬和皮質PI3K、β-catenin陽性表達比較

2.3HE染色評估組織學改變 S組神經元數量不僅多，且形態完整，排列整齊。I/R組和LY組中觀察到神經元數量減少，分布不均，細胞周圍間隙變寬，胞體腫脹明顯，視野下部分細胞體積縮小，細胞核呈典型的固縮深染，特別是LY組腦組織損傷更重，組織學變化更明顯。IGF-1組皮質和海馬中存活的神經元數量、神經元細胞腫脹程度及細胞形態比I/R組和LY組均有明顯改善。見圖1。

圖1 血管性癡呆大鼠皮質和海馬HE染色(×400)

2.4免疫組織化學染色檢測皮質和海馬PI3K、β-catenin表達 S組皮質和海馬少量表達PI3K、β-catenin陽性產物。I/R組皮質和海馬PI3K、β-catenin陽性產物較S組顯著增多(P<0.05)。LY組PI3K、β-catenin表達較I/R組明顯減少(P<0.05)。IGF-1組PI3K、β-catenin表達較I/R組明顯增加(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 血管性癡呆大鼠海馬PI3K和皮質β-catenin陽性細胞表達(免疫組化染色，×400)

3 討 論

PI3K是一組與質膜相關的脂質激酶，它參與細胞的生長、運動、凋亡、代謝和血管生成的過程。在神經系統中，PI3K參與神經元和神經膠質細胞的生存和分化。PI3K/Akt信號轉導通路是重要的細胞內信號轉導途徑，在多種細胞因子介導的細胞存活中起重要作用。IGF-1作為神經營養因子，廣泛分布在中樞神經系統中，可以通過刺激海馬等區域的神經發生而發揮神經保護和增殖功能，還可以與其受體的結合激活細胞內PI3K/Akt信號轉導通路防止細胞凋亡〔7～10〕。本研究結果說明，IGF-1促進PI3K/Akt通路信號分子PI3K的表達在缺血性皮質和海馬損傷修復過程中起到重要作用。

Wnt/β-catenin信號通路重要分子β-catenin是一種胞內糖蛋白，分子量在92 kD，在指導多種細胞功能中β-catenin起著核心作用：首先，它通過與E-鈣黏蛋白細胞黏附形成復合物，參與細胞間的黏附，維持組織結構的完整性和極性，介導細胞同質黏附〔11～13〕。其次，作為重要的信號分子，β-catenin與T細胞轉錄因子/淋巴細胞增強因子家族成員一起在形成復合物，直接調控下游基因的轉錄，從而調控細胞的存活增殖〔14～16〕。本實驗結果顯示，IGF-1在缺血性腦損傷中能夠激活PI3K，通過PI3K/Akt信號通路影響β-catenin的表達。

PI3K/Akt信號途徑參與血管性癡呆大鼠皮質和海馬神經元損傷修復，不但是重要的細胞存活通路，而且可以通過Wnt/β-catenin信號通路及其下游基因進一步促進缺血性腦損傷后的修復作用。這意味著這兩條通路的主要成員PI3K和β-catenin有可能成為缺血性腦損傷治療中重要的靶分子。