白花丹素對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝的保護(hù)作用

李偉華 任維華 楊麗 劉艷萍

(濟(jì)南市人民醫(yī)院藥劑科，山東 濟(jì)南 271199)

糖尿病腎病(DN)最主要的特征是糖尿病腎小球細(xì)胞的硬化。糖尿病患者的生命健康直接受到糖尿病腎病的嚴(yán)重威脅。白花丹素是藥用植物西蘭花的主要活性成分。研究表明白花丹素具有多種生物學(xué)作用，如抗炎、抗血管生成、抗癌和抗氧化活性。本研究采用腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)的方法制備大鼠糖尿病模型，采用白花丹素治療，通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)，明確其對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝的作用療效。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 Wistar雄性大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)；白花丹素(上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司)；血糖儀(美國(guó)雅培)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡)；自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)徠卡)；AU2700全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved capase)-3單克隆抗體、兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、對(duì)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備 20只8周齡Wistar雄性大鼠，體重170～200 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。禁食24 h后，按60 mg/kg腹腔注射STZ，STZ濃度為1%，溶解于pH 4.0新鮮配制的檸檬酸-二水合檸檬酸納緩沖液中。24 h后，通過(guò)大鼠尾靜脈取血測(cè)定血糖，凡血糖值>250 mg/dl，即納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 30只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(Con)組，模型(DM)組和模型+白花丹素(DM+PB)組，每組10只，糖尿病模型成模8 w末，分組進(jìn)行腹腔內(nèi)給藥，Con組和DM組給予生理鹽水2 mg/kg，DM組+PB組給予百花丹素溶液2 mg/kg。給藥4 w后，測(cè)量各組大鼠血糖后處死。

1.2.3腎臟蘇木素-伊紅(HE)染色 取大鼠腎臟少量剪成小塊，經(jīng)切片染色后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.4脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 血漿總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、游離脂肪酸(FFA)和腎臟TC采用日本奧林巴斯 AU2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.2.5氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 右腎制備腎組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)分別測(cè)定SOD 活性、MDA 含量和NO 含量。

1.2.6免疫組化(SP) 采用SP法測(cè)定腎組織中纖連蛋白、Cleaved Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)，顯色結(jié)果在高倍鏡下隨機(jī)選取20個(gè)連續(xù)不重復(fù)的視野，計(jì)數(shù)每視野陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，取其均值表示該因子表達(dá)強(qiáng)度。所有操作內(nèi)容嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7Western印跡檢測(cè)各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平 取腎臟組織100 mg放入試管，剪碎，裂解液充分研磨，冰上裂解1 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)蛋白濃度(Bio-Rad試劑盒)，分別取50 μg蛋白樣本經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后(于4%～12% SDS-PAGE)2 h，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，與一抗(兔抗鼠，1∶100)37℃搖床孵育2.5 h，PBST洗滌后，與二抗(羊抗兔,1∶250)37℃搖床孵育0.5 h。PBST洗滌后經(jīng)電化學(xué)發(fā)光(ECL)熒光顯色，SMARTVIEW軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1腎小體病理學(xué)改變 與Con組相比，DM組腎小球基底膜增厚，腎小球系膜基質(zhì)增加，腎小球面積百分比增加，纖連蛋白表達(dá)百分比增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。與DM組相比，DM+PB組腎小球基底膜增厚減少，腎小球系膜基質(zhì)增加減少，腎小球面積百分比減少，纖連蛋白表達(dá)百分比減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 HE染色和纖連蛋白染色觀察各組腎小體病理學(xué)改變(×100)

2.2腎組織中MDA、NO、GSH和SOD的表達(dá) 與Con組比較，DM組MDA、NO含量升高、GSH和SOD含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與DM組比較，DM+PB組腎組織中MDA、NO表達(dá)均降低，GSH和SOD表達(dá)均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組腎小球面積、纖連蛋白、腎臟中MDA、NO、GSH和SOD表達(dá)比較

2.3脂質(zhì)代謝變化 DM組血漿TC、TG、FFA及腎臟TG含量均較Con組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；DM+PB組血漿TC、TG、FFA及腎組織TG含量均較DM組下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4Cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2表達(dá) 與Con組比較，DM組Cleaved Caspase-3和 Bax蛋白表達(dá)均增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與DM組比較，DM+PB組Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)均降低，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2、圖3。

表2 白花丹素對(duì)糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3表達(dá)的影響

圖2 各組增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑染色(×100)

圖3 各組Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表達(dá)

3 討 論

研究表明，30%～40%的糖尿病患者合并DN〔1,2〕。大量研究表明DN發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常〔3～5〕。白花丹素是百花丹等植物的自然提取物，研究報(bào)道白花丹素具有多種藥理活性，包括抗炎、抗癌和抗菌等作用〔6,7〕。

過(guò)往研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用〔8〕。MDA是反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激的一個(gè)良好指標(biāo)，MDA的量可反映機(jī)體自由基的含量和脂質(zhì)過(guò)氧化程度。NO在體內(nèi)具有血管活性和細(xì)胞毒性的雙重作用。能夠?qū)2-轉(zhuǎn)化為H2O2或O2，構(gòu)成抗氧化應(yīng)激的第一道防線。因此，SOD活力可反映機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。本實(shí)驗(yàn)提示，白花丹素可改善糖尿病大鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。 氧化應(yīng)激通過(guò)激活線粒體、損傷DNA、影響NF-κB基因表達(dá)等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8〕。細(xì)胞凋亡是一個(gè)由Caspase蛋白激酶家族介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，屬于一類(lèi)新的癌基因家族；Bcl-2 和Bax 是Bcl-2 家族的兩個(gè)重要成員，Bcl-2是抑制凋亡的主要基因，而B(niǎo)ax是促凋亡基因，它們和其家族成員共同構(gòu)成了復(fù)雜的相互作用的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生，兩者比例失調(diào)則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)表明，高血糖會(huì)引起糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。白花丹素可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá)量，緩解氧化應(yīng)激誘發(fā)的腎臟損傷，從而抑制糖尿病大鼠細(xì)胞凋亡。糖尿病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中伴隨著脂質(zhì)代謝紊亂，降低糖尿病脂質(zhì)代謝對(duì)于糖尿病治療具有非常重要的作用〔9,10〕。

綜上，白花丹素可以降低糖尿病大鼠腎組織中MDA、NO表達(dá)，提高GSH和SOD含量，緩解氧化應(yīng)激損傷；同時(shí)白花丹素降低糖尿病大鼠TC、TG、FFA以及腎組織TG含量減輕脂質(zhì)代謝紊亂，對(duì)糖尿病腎病起到積極的治療和保護(hù)作用。