線粒體自噬對術前睡眠剝奪老齡大鼠術后認知功能的影響

陳勇 姚鵬 詹芬芳 王忠 胡衍輝 余樹春 徐國海

(1 南昌大學第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術期醫(yī)學科 江西省麻醉學重點實驗室，江西 南昌 330006；2孝感市中心醫(yī)院)

隨著全球老齡化社會的到來以及現(xiàn)代醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，老年人手術種類及數(shù)量日趨增多，伴隨著麻醉技術、手術操作及監(jiān)護儀器等各方面的大大提高，老年患者術后死亡率已明顯下降，但臨床研究發(fā)現(xiàn)，老年患者術后認知功能障礙(POCD)的發(fā)生率卻顯著增加。手術和高齡等是導致POCD的主要影響因素〔1〕，且手術和高齡均對睡眠質(zhì)量有重要影響，尤其是老年患者，術前睡眠剝奪屬于普遍現(xiàn)象，研究表明其可加重認知障礙〔2〕，但具體機制尚不清楚。線粒體自噬是指損傷的線粒體通過自噬機制選擇性清除受損的細胞器和蛋白質(zhì)〔3〕，線粒體自噬參與腦缺血再灌注損傷過程〔4〕，但其對術前睡眠剝奪老齡大鼠術后認知功能的影響尚不清楚，本研究擬通過建立睡眠剝奪老齡大鼠模型，觀察大鼠發(fā)生認知障礙時線粒體自噬的表達情況。

1 材料與方法

1.1動物選擇及分組 選擇64只SPF級健康雄性SD大鼠，20～22月齡，體重550～700 g，將大鼠隨機分為對照(C)組、睡眠剝奪(SD)組、手術(S)組和睡眠剝奪+手術(SS)組各16只。SD組和SS組采用改良多平臺水環(huán)境睡眠剝奪法建立睡眠剝奪模型，S組和SD組行脛骨骨折加髓內(nèi)固定術。

1.2睡眠剝奪大鼠模型的建立 參照文獻〔5〕介紹的方法：選擇透明水箱(20 cm×30 cm×40 cm)，水箱內(nèi)放10個圓形平臺(高5 cm、直徑2 cm)，每兩個平臺之間距離為5 cm，然后向水箱中注水，使平臺高出水面1 cm，將大鼠放到平臺上進行連續(xù)72 h的睡眠剝奪，同時持續(xù)給予日光燈照射。

1.3脛骨骨折加髓內(nèi)固定術 參照文獻〔6〕介紹的方法在大鼠睡眠剝奪結(jié)束后24 h進行。將大鼠麻醉后，對其右后肢進行開放性脛骨骨折手術，同時行髓內(nèi)固定術。C組和SD組僅接受與S組相同的麻醉。

1.4條件性恐懼記憶實驗 分別于術后1、3、7 d(T1～T3)時采用Fear Condition實驗測定大鼠認知功能。將大鼠放入條件恐懼箱中適應環(huán)境3 min，并測定其“僵立”時間。24 h后開始恐懼訓練，將大鼠放入原條件恐懼箱中適應2 min，并給予電擊(1 s，45 V)，間歇2 min 后再次給予電擊，共電擊3次，適應性訓練結(jié)束后將大鼠放在條件恐懼箱內(nèi)停留30 s。適應性訓練結(jié)束1 h后，將大鼠再次放入恐懼箱內(nèi)，觀察其3 min內(nèi)每一次的“僵立”時間，同時計算條件誘導僵立時間百分比。

1.5TUNEL檢測 于術后第7天行為學測定完畢后立即處死取海馬組織，采用TUNEL檢測海馬神經(jīng)元凋亡情況。海馬組織乙醇脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟脫水，3% H2O2室溫避光30 min,枸櫞酸鹽緩沖液洗滌,煮沸15 min,冷卻后漂洗,滴加50 μl TdT酶反應液反應60 min后；加辣根過氧化物酶-鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)標記液，避光30 min。滴加50 μl DAB底物溶液,室溫15 min,漂洗后滴加蘇木素染色1 min,沖洗、脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察，每張切片選取5個視野，取平均值。

1.6透射電鏡檢測 采用透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元自噬情況。取海馬組織，1%鋨酸固定，常規(guī)脫水、透明，Epon 812包埋，制備厚度50～80 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色。采用透射電鏡進行觀察，并拍照記錄。

1.7線粒體膜電位 采用JC-1探針法測定線粒體膜電位。先使用組織線粒體分離試劑盒獲取線粒體，參照JC-1檢測試劑盒使用說明書推薦比例稀釋JC-1，配制染色工作液。取稀釋好的JC-1染色工作液，加入純化線粒體。將兩者混勻后，采用激光共聚焦顯微鏡分別測定紅綠熒光強度，并計算兩者的比值，用于反映海馬神經(jīng)元線粒體膜電位。

1.8海馬LC3、Beclin1、Parkin及p62蛋白表達的測定 采用Western印跡法進行檢測。取大鼠腦海馬組織，加入裂解液和磷酸酶抑制劑勻漿裂解提取胞質(zhì)和線粒體蛋白，測定蛋白濃度，標記后-20℃保存。各取蛋白樣品上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳至指示帶分離，然后轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂牛奶室溫封閉，加入一抗(稀釋度1∶1 000，Abcam公司，美國)及內(nèi)參GAPDH(稀釋度1∶1 000)4℃孵育過夜。次日TBST漂洗，然后孵育辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，電化學發(fā)光(ECL)試劑顯影，Image Lab 拍照分析，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白相對表達水平。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.14組術后條件誘導僵立時間百分比比較 與C組比較，其余3組術后條件誘導僵立時間百分比明顯降低(P<0.05)；與SD組和S組比較，SS組術后條件誘導僵立時間百分比明顯降低(P<0.05),見表1。

表1 4組術后條件誘導僵立時間百分比比較

2.24組海馬線粒體膜電位、LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ、Beclin1、Parking及p62蛋白表達比較 C組在熒光濾片上觀察為高紅高綠，染料聚集明顯；與C組比較，S組和SD組表現(xiàn)為中紅高綠，紅色熒光下可見較多染料聚集，提示膜電位下降；與S組和SD組比較，SS組表現(xiàn)為低紅高綠，紅色熒光下僅有極少量染料聚集呈現(xiàn)亮紅色，提示膜電位明顯下降，見表2、圖1。與C組比較，其余3組海馬LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1及Parkin蛋白表達明顯增加，p62蛋白表達明顯減少(P<0.05)；與SD組和S組比較，SS組海馬LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin 1及Parkin蛋白表達明顯增加，p62蛋白表達明顯減少(P<0.05)，見表2。

圖1 4組海馬線粒體膜電位的變化(醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，×200)

表2 4組海馬、線粒體膜電位、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、Parkin及p62蛋白表達比較

2.34組海馬神經(jīng)元凋亡情況 C組海馬組織存在少量散在凋亡細胞；與C組〔(4.2±0.6)%〕比較，其余3組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；與SD組〔(26.8±1.8)%〕和S組〔(28.4±1.7)%〕比較，SS組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯升高〔(38.5±2.6)%，P<0.05〕，見圖2。

圖2 4組海馬神經(jīng)元凋亡情況(TUNEL染色，×100)

2.44組海馬組織超激結(jié)構(gòu)的變化 C組大鼠海馬線粒體分布均勻，線粒體膜完整，線粒體嵴清晰可見，未見明顯損傷的線粒體，無典型的線粒體自噬結(jié)構(gòu)；S組和SD組可見線粒體腫脹和空泡樣變性，并可見少量的自噬體形成；SS組可見線粒體明顯腫脹，內(nèi)部嵴破壞或消失，且呈現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，見圖3。

圖3 4組海馬組織超微結(jié)構(gòu)的變化(透射電鏡，×2 500)

3 討 論

條件性恐懼記憶實驗主要用于測定動物學習、記憶和環(huán)境暗示之間的關聯(lián)能力。僵立是實驗動物防御行為的一種，也是評價嚙齒類動物恐懼的可靠指標〔7〕。僵立持續(xù)的時間越短，則證明動物學習記憶能力越差，反之，則證明動物學習能力越強。因老年患者術前睡眠障礙發(fā)生率較普通患者明顯升高，因此，本研究選擇老齡大鼠作為研究對象，能夠較好地模擬老年術前睡眠剝奪現(xiàn)象。本研究結(jié)果提示，大鼠POCD模型制備成功。

本研究結(jié)果提示，術前睡眠剝奪或手術均可導致老齡大鼠認知功能障礙，且術前睡眠剝奪可進一步加重老齡大鼠術后認知功能障礙。

有研究表明，線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，并且對機體有一定的保護作用〔8，9〕。透射電鏡是檢測自噬體的金標準，線粒體是細胞凋亡的控制中心，跨膜電位的穩(wěn)定也是線粒體功能正常的標志，當細胞發(fā)生凋亡時，可促使線粒體形態(tài)及功能發(fā)生變化，使線粒體膜電位下降或消失〔10〕。此外，LC3及Beclin1也是線粒體自噬的重要參與基因。LC3可分為LC3-Ⅰ型和LC3-Ⅱ型，正常情況下，主要以LC3-Ⅰ型表達，當發(fā)生自噬時，LC3-Ⅰ可經(jīng)泛素化形成LC3-Ⅱ，因此LC3也是特異性的自噬診斷指標。Beclin1也稱BECNl基因，是自噬起始的限速基因，也是自噬的調(diào)節(jié)蛋白，參與了線粒體自噬過程〔11〕。Parkin 廣泛表達于各組織和器官，尤以腦、心肌和骨骼肌等高耗能器官中含量豐富,主要介導底物泛素化，調(diào)節(jié)蛋白降解和信號轉(zhuǎn)導等，可作為線粒體受損時的第一道防線〔12〕。p62在線粒體自噬中，發(fā)揮著標記作用，同時也起到聚集受損的蛋白、線粒體及形成自噬小體的作用，且其表達水平與自噬活性呈反比〔13〕。本研究提示，術前睡眠剝奪可進一步加重老齡大鼠術后認知功能障礙，其機制可能與抑制線粒體自噬的過度激活有關，但具體通過哪條信號通路進行調(diào)節(jié)及如何抑制線粒體自噬激活尚不清楚，這也是下一步的研究方向。

綜上，術前睡眠剝奪可進一步加重老齡大鼠術后認知功能障礙，其機制可能與抑制線粒體自噬的過度激活有關。