早期運動干預對糖尿病大鼠心肌結構和纖維化的影響

金山虎，艾 盼，彭亞力，扈 盛

（1.武漢體育學院 體育科技學院，湖北 武漢 430079；2.武漢體育學院 健康科學學院，湖北 武漢 430079；3.華中師范大學 體育學院，湖北 武漢 430079）

糖尿病是一種常見的慢性代謝障礙性疾病，全球糖尿病患病人數處在持續增長的階段。IDF（International Diabetes Federation）最新數據顯示，預計到2030年，全球糖尿病患者將會達到5.8億［1］。糖尿病誘發的心臟結構和功能改變，是糖尿病的并發癥之一。其主要表現為心肌纖維化、代謝失調以及心肌細胞肥大和凋亡。目前，研究認為糖尿病誘導的心肌結構和功能改變，獨立于其他心臟危險因素發生［2］。運動干預已被證實是一種經濟有效地治療手段，可以通過影響心肌代謝，增強心肌抗氧化能力，從而減輕機體高糖環境誘導的心肌纖維化，同時改善心肌病理性重塑和心臟收縮舒張功能。但是，運動前干預對T2DM誘導的心肌纖維的影響還不確定。本實驗，擬通過在高糖高脂膳食聯合低劑量STZ構建T2DM大鼠模型的過程中增加中等強度的跑臺運動干預，以探究中等強度的運動干預對T2DM誘導的心肌結構改變和心肌纖維化的預防作用，為制定預防糖尿病心肌損傷的運動處方提供理論依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

6周齡SPF級雄性SD大鼠30只，購自湖北省實驗動物研究中心（許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，No.42000600025097），體重180～220g之間，在武漢體育學院SPF級實驗室進行飼養訓練。環境溫度和濕度分別為20～22℃、40%～70%，光照12h周期交替，自由進食、飲水。所有操作均嚴格遵守武漢體育學院道德倫理委員會要求。

1.2 實驗分組

30只大鼠喂養1周適應環境后，隨機分為NC組（對照組）、DM組（T2DM造模 組）、ME組（中等強度 運動組），每組10只。NC組標準嚙齒類動物飼料喂養，DM、ME組均高糖高脂飼料喂養（基礎飼料64.5%、蔗糖18%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇2%、膽酸鈉0.5%），自由飲水進食；NC、DM組均籠中自由活動，ME組在高糖高脂飼料喂養期間進行中等強度的跑臺運動。

1.3 實驗造模

實驗開始前，進行3d運動預適應；ME組跑臺坡度為5°，速度為15m/min［3-4］。周1至周5訓練，每次訓練1h，持續訓練8周。于第8周末，隔夜禁食不禁水12h，采用30mg/kg劑量，NC組腹腔注射濃度為0.1mmol/L的SSC（檸檬酸緩沖液），DM組和ME組腹腔注射2%STZ溶液。于注射后第7天尾靜脈取血測大鼠隨機血糖，以隨機血糖≥16.7mmol/L為T2DM成模標準［5］。

1.4 主要儀器和試劑

ZS-PT大鼠跑臺（北京眾實迪創科技發展有限公司）；TGL18M離心機（凱達科學儀器有限公司）；STZ（美國Sigma生物技術公司，批號：WXBC6558V）；stepone plus型Real Time-PCR儀（美國ABI）。

1.5 組織取材及處理

STZ注射后第8天，尾靜脈取血，測隨機血糖；隨后禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取心臟，在心尖、心底連接線中點橫切心臟一份為二，心底端部分置于多聚甲醛固定液中，制作石蠟切片，后進行蘇木精-伊紅（HE）染色；心尖部置于-80℃，用于免疫組化和PCR（qRT-PCR）。

1.5.1 心室壁厚度

將HE染色切片進行電子掃描，用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件在電子掃描片上測量左心室前壁、側壁、后壁和室間隔的厚度，取平均值為平均厚度［6］。

1.5.2 免疫組化測定α-SMA

首先切片脫蠟、透明劑處理、梯度乙醇至水、修復、冷卻、沖洗、3%H2O2處理、沖洗、一抗、二抗孵育、沖洗、滴加50μL新鮮DAB、復染、分化、返藍、脫水干燥、透明、封固；然后顯微鏡下觀察α-SMA的表達及分布，用Image-Pro Plus6.0軟件對圖片進行分析，計算累計吸光度值。

1.5.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

先提取組織RNA，然后進行逆轉錄，準備miR-133a、U6PCR引物（見PCR引物表）。先用離心機離心再開蓋，然后DEPC水稀釋溶解，置于-20℃冰箱中備用。在50℃，2min；95℃，2min；95℃，10s和60℃，30s的反應條件下，以逆轉錄合成的cDNA為模板，循環40次完成PCR擴增反應。完成以后，通過調整基線及閾值。目的基因表達水平計算公式：目的基因相對量=2-△△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。miR-133a逆轉錄引物RT-mmu-miR-133a-3p，引物序列5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACCAGCTG-3’；正向引物mmu-miR-133a-3p-FP，引物序列5’-CCCTTTGGTCCCCTTCAAC-3’；反向引物RP2，引物序列5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’。U6逆 轉 錄 引 物RTU6-2，引物序列5’-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3’；正向引物U6-2-F，引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’；反向引物U6-2-R，引物序列5’-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3’。

1.6 統計學分析

采用SPSS20.0進行統計學分析，計量資料以均值加減標準差（±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析，當p＜0.05時為差異有顯著性，當p＞0.05時為差異無顯著性。

2 研究結果

2.1 各組大鼠隨機血糖

與NC組 （4.88±0.61mmol/L）相 比，DM組 （22.60±5.48mmol/L）、ME組（16.26±6.23mmol/L）隨 機 血 糖 都 有 顯 著性增加（p＜0.05）；與DM組相比，ME組有顯著性下降（p＜0.05）。

2.2 各組大鼠心肌HE染色和左心室室壁厚度

圖1顯示，NC組心肌細胞排列整齊，結構清晰，無明顯病理改變；DM組心肌細胞排列疏松、紊亂，可見心肌斷裂，細胞核明顯增大，染色質凝聚、趨邊。胞漿崩解，心肌細胞橫紋溶解，可見明顯空泡變性、脂肪空泡；ME組大部分心肌細胞排列整齊，未見心肌斷裂，無明顯空泡變性，胞漿染色較為均勻。

圖1 各組大鼠心肌HE染色（400×）

測量左心室壁厚度，與NC組（2.17±0.47mm）相比，DM組（3.24±0.55mm）、ME組 （2.48±0.35mm）有顯著性增加 （p＜0.05）；與DM組相比，ME組有顯著性下降（p＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌α-SMA表達結果

圖2顯示，NC組α-SMA蛋白陽性表達較少，淡棕色染色陽性顆粒分布均勻、稀疏；DM組α-SMA蛋白陽性有較多表達，淡棕色染色陽性顆粒分布濃密；ME、組α-SMA蛋白陽性表達減少，淡棕色染色陽性顆粒較DM組明顯稀疏。DM組（1 668.84±1 527.14）、ME組（565.32±560.89）α-SMA與NC組（325.41±372.77）相比，IOD值都有顯著性增加（p＜0.05）；ME組α-SMA與DM組相比，IOD值有顯著性下降（p＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌α-SMA的表達

2.4 各組大鼠心肌miR-133a的表達結果

測量各組大鼠心肌組織中miR-133a的表達量，NC組（1.08±0.19）、DM組（1.21±0.37）、ME組（1.11±0.22）之間沒有顯著性差異。

3 分析與討論

3.1 中等強度運動對隨機血糖的影響

眾多研究表明［7-8］，8周高糖高脂喂養配合低劑量STZ一次性腹腔注射構建T2DM大鼠模型的方法，穩定性好，可復制性強。本實驗采用此方法構建T2DM模型，并在模型構建過程中加入中等強度的跑臺運動，結果顯示DM組隨機血糖顯著高于NC組，說明本實驗T2DM大鼠模型構建成功。而ME組隨機血糖顯著低于DM組，提示在T2DM形成過程中加入運動干預，可有效預防隨機血糖的增長。有研究證明［9-10］，運動可以調動更多的肌纖維，在消耗儲存糖原的同時提高葡萄糖轉運蛋白的含量，增加糖攝取能力進而改善血糖水平。本課題組其他研究也證實，在T2DM形成過程中加入中等強度運動，能有效干預空腹血糖、糖化血清蛋白的增長，從而有效預防或延遲T2DM的形成［11-12］。

3.2 中等強度運動對心肌結構的影響

糖尿病心肌損傷是糖尿病并發癥之一，是導致糖尿病患者慢性心力衰竭及心源性死亡的重要原因。其可以導致心臟脂質沉積、心肌纖維化及心肌細胞死亡的增加等諸多心肌病理性改變，進而引起左心室的肥厚及收縮功能下降［13］。本實驗心肌組織HE染色結果顯示，DM組心肌細胞排列疏松、紊亂，可見心肌纖維斷裂，細胞核增大，有炎性細胞浸潤，脂肪空泡形成，這與儲全根［14］等人在糖尿病心肌病的研究中的結果相同。左心室室壁厚度的增加是心肌肥厚及左心室重建的重要表現，本實驗在心肌組織HE染色電子掃描片上測量左心室前、側、后以及室間隔的厚度，取平均值為左心室厚度，發現DM組左心室室壁厚度較NC組有顯著增加。杜常青［15］等人用心臟超聲觀察T2DM大鼠模型，出現了左心室室壁顯著增厚，并同時伴有心功能降低、心肌細胞肥大的發生。Eguchi等人也證實了高血糖與左心室肥厚明顯相關［16］。

運動作為一種干預手段，對于糖尿病及其引起的心肌損傷，都有很重要的防治作用。有學者發現，有氧運動能夠增強心肌抗氧化能力，減輕心肌纖維化，抑制糖尿病誘導的病理性心肌重塑，改善心臟舒縮功能［17-18］。本研究在T2DM模型建立過程中加入運動干預，結果顯示ME組相較于DM組心肌細胞排列趨于整齊，細胞間隙變小，空泡樣變性減少。并且ME組的左心室室壁厚度較于DM組也有顯著性下降，說明在T2DM形成過程中增加中等強度運動干預可以有效預防糖尿病引起的心肌結構改變。王世強［19］等人的研究表明，有氧運動可能通過增強心肌自噬能力，進而改善糖尿病大鼠心肌結構及功能。田閣［20］等人對高脂誘導的糖尿病小鼠進行8周的運動干預后，也出現了小鼠心肌血管纖維化比例顯著降低，心肌細胞橫截面積減小的現象。可見，有氧運動可以改善糖尿病誘導的心肌重塑。

3.3 不同強度運動對心肌α-SMA的影響

適量的運動可以降低血糖、提高胰島素敏感性、抑制心肌纖維化、改善氧化應激，在糖尿病早期心肌纖維化的防治中發揮著重要作用［21］。糖尿病大鼠體內的高糖環境，促使心肌成纖維細胞（CFs）分化成特異性表達α-SMA的肌成纖維細胞（MFB）并分泌大量的細胞外基質是心肌纖維化的標志［22］。在肖明洋［23］等人的研究中，糖尿病對照組大鼠心肌纖維化情況較嚴重，心肌組織中α-SMA蛋白表達水平也較正常對照組顯著升高。這與本實驗的研究結果相似，說明T2DM引起了心肌纖維化。多項研究發現［21，24-25］，適量的運動可以通過降低血糖、抑制基質金屬蛋白酶－2含量、改善機體能量代謝以降低心肌內糖原沉積等多種途徑抑制心肌纖維化。劉雨佳［26］等人的研究還發現，有氧運動還可以通過增強機體抗氧化酶的表達，改善心肌纖維化。本實驗在T2DM造模過程中加入中等強度的跑臺運動，結果顯示ME組心肌組織α-SMA的表達量比DM組有顯著下降，說明在T2DM形成過程中加入運動干預，可以有效地預防糖尿病引起的心肌纖維化。但是，與NC組相比，DM組和ME組心肌組織α-SMA的表達量都有顯著增加，說明運動干預雖然一定程度上降低心肌α-SMA的表達，有效減緩心肌纖維化，但在T2DM發展過程中，運動干預并不能完全阻斷心肌纖維化的發生。

3.4 中等強度運動對心肌miR-133a的影響

miRNA作為內源性調節因子，可通過抑制翻譯或裂解靶mRNA以調節轉錄后的基因表達。miR-133a作為心臟中表達最豐富的miRNA之一，有文獻報道，其參與了糖尿病心肌纖維化的進程；可以通過靶向上調轉錄因子MEF2誘導心肌肥大；還通過影響心肌鉀離子慢通道，一定程度上參與糖尿病心肌 損 傷 的 病 理 生 理 過 程［27-29］。Nandi［30］等 人 的 研 究 發 現miR-133a在STZ誘導的糖尿病小鼠心肌中過表達。但是本實驗結果中正常組、糖尿病造模組、運動干預組心肌組織中的miR-133a的表達均無顯著性差異。推測可能是本實驗在造模結束后即刻，即處死大鼠取材，病理病程相對較短，僅僅引起了心肌室厚度的增加和α-SMA表達量的改變，并未引起基因水平上發生明顯改變，提示心肌組織代償能力較強。

4 結論

在8周高糖高脂膳食聯合低劑量STZ構建T2DM大鼠模型過程中，中等強度有氧運動干預可以有效控制隨機血糖的增長，降低左心室室壁的異常增厚，減緩心臟形態結構的病理改變，減少大鼠心肌組織中α-SMA的表達，減緩糖尿病誘發的心肌纖維化。但是在T2DM形成過程中并不能引起心肌miR-133a表達量的改變，提示心肌代償能力較強。