羊肚菌白霉病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

蘇文英，劉曉梅，紀(jì)偉，梁長(zhǎng)東，趙書(shū)光，任立凱*

(1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222006；2.灌南縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇 連云港 222006)

羊肚菌(Morchella)是一種珍稀食藥用菌，在菌物分類(lèi)學(xué)上隸屬于子囊菌亞門(mén)(Ascomycota)、盤(pán)菌綱(Discomycetes)、盤(pán)菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)[1]。羊肚菌風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，富含多種蛋白質(zhì)及人體所需氨基酸，具有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，能夠抗疲勞、保肝、保腎、調(diào)血脂及保護(hù)胃腸功能等作用，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。由于羊肚菌產(chǎn)業(yè)成本低、見(jiàn)效快、效益高的優(yōu)勢(shì)，其栽培區(qū)域由最初的川渝地區(qū)迅速擴(kuò)張，現(xiàn)如今全國(guó)各地除海南以外的各省份均有種植[4-5]。羊肚菌屬于土腐生類(lèi)型，菌絲體需要在土壤中的有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、水分及各種微生物的作用下才能出菇。因此，羊肚菌大田栽培占全行業(yè)栽培的90%以上，整個(gè)栽培過(guò)程羊肚菌菌絲體及子實(shí)體都暴露在外界環(huán)境中，與環(huán)境中的各種生物體接觸，容易招致各種病蟲(chóng)害侵襲，給生產(chǎn)帶來(lái)?yè)p失。此外，在栽培管理后期，高溫高濕的環(huán)境也會(huì)加劇病害的發(fā)生和蔓延[6]。

近幾年，羊肚菌病害在全國(guó)范圍內(nèi)頻發(fā)，病害種類(lèi)包括細(xì)菌性病害和真菌性病害，細(xì)菌性病害主要為軟腐病及紅體病；真菌性病害主要為白霉病。羊肚菌白霉病是其子實(shí)體時(shí)期最主要的病害，發(fā)病時(shí)子實(shí)體受侵染部位被白色絨毛狀菌絲覆蓋，嚴(yán)重時(shí)子實(shí)體受侵染部位會(huì)枯萎，病害發(fā)生率達(dá)60%～80%，使羊肚菌的商品性狀和經(jīng)濟(jì)價(jià)值大打折扣，給種植戶(hù)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，羊肚菌白霉病菌適應(yīng)性極強(qiáng)，且能快速傳播，一旦發(fā)病極難控制。因此，掌握羊肚菌白霉病病原菌的物種歸屬及生物學(xué)特性，對(duì)于該病害的預(yù)防和控制及進(jìn)一步提升羊肚菌種植的經(jīng)濟(jì)效益具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

本研究通過(guò)對(duì)羊肚菌白霉病病原菌的分離鑒定及生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為該病害的早期診斷和科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2020年3月在江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，采集發(fā)病子實(shí)體并帶回實(shí)驗(yàn)室，觀察記錄病害癥狀。

1.2 供試培養(yǎng)基

MYG培養(yǎng)基(稱(chēng)取10 g麥芽糖、5 g葡萄糖、5 g酵母浸粉、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(稱(chēng)取20 g葡萄糖、10 g蛋白胨、1 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(稱(chēng)取200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；薩氏(SDAY)培養(yǎng)基(稱(chēng)取10 g酵母浸粉、40 g葡萄糖、10 g蛋白胨、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；察氏(Czapek)培養(yǎng)基(稱(chēng)取2 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4、0.01 g FeSO4、30 g蔗糖、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)，所有培養(yǎng)基均在121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.3 病原菌的分離與鑒定

采用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離和純化，在超凈工作臺(tái)中，用75%乙醇棉擦拭病害子實(shí)體表面，用接種刀切取病健交界處1～2 mm的組織塊置于MYG平板內(nèi)于25 ℃下恒溫培養(yǎng)。待組織塊周?chē)L(zhǎng)出菌絲，切取尖端菌絲轉(zhuǎn)至新的MYG培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。共獲得1個(gè)菌株標(biāo)記為JS-1，菌株在MYG培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后置于4 ℃保藏備用。

利用基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京)提取病原真菌DNA，選擇通用引物ITS1、ITS4對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)正確后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)。通過(guò)比對(duì)測(cè)序結(jié)果，選取相似性較高的菌株相關(guān)種屬序列，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

將菌株JS-1接種于MYG平板上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)10 d，觀察記錄菌落特征及顯微形態(tài)。

根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行回接致病性檢測(cè)。

1.4 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

用8 mm打孔器在致病菌菌落邊緣打孔，將菌塊分別接種于PDA培養(yǎng)基、SDAY培養(yǎng)基、MYG培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基上，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，于25 ℃恒溫暗培養(yǎng)。培養(yǎng)期間觀察記錄菌絲均勻度及密度等長(zhǎng)勢(shì)情況，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。

1.4.2 碳源試驗(yàn)

分別以等量麥芽糖、淀粉、蔗糖、乳糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，121 ℃滅菌20 min后倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑8 mm的打孔器取菌塊接種于平板中央，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

1.4.3 氮源試驗(yàn)

分別以等量硫酸銨、酵母浸粉、氯化銨、尿素替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，121 ℃滅菌20 min后倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑8 mm的打孔器取菌塊接種于平板中央，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

1.4.4 溫度試驗(yàn)

將接種后的平板培養(yǎng)皿分別置于15、20、25、30、35、40 ℃條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)(培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

1.4.5 pH試驗(yàn)

用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)各培養(yǎng)基初始pH為5、6、7、8、9，觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

2020年3月對(duì)連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地羊肚菌大棚調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病初期在子實(shí)體上出現(xiàn)白色小斑點(diǎn)，斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大并穿孔，幼小的子實(shí)體被病原菌的白色菌絲覆蓋，最終停止生長(zhǎng)(圖1中A和B)。

2.2 病原菌的分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定

從發(fā)病羊肚菌樣品中，分離獲得致病菌JS-1。將致病菌菌餅覆蓋在羊肚菌菌帽部分，再置于培養(yǎng)皿中，3次重復(fù)，保濕培養(yǎng)若干天，直至有病斑形成，將病斑部位再進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過(guò)培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及ITS序列確定分離到的病原菌與發(fā)病菌株的致病菌為同一株病原菌。

在MYG培養(yǎng)基和25 ℃黑暗條件下，菌株JS-1的菌落初期為白色，輪狀生長(zhǎng)，邊緣規(guī)則，菌絲絨毛狀，較發(fā)達(dá)，后期菌絲生長(zhǎng)部位培養(yǎng)基萎縮(圖1中C)。分生孢子梗側(cè)生，分生孢子呈鏈?zhǔn)剑环稚咦訔l形或梭形，有間隔(圖1中D)。

A—自然感病子實(shí)體；B—感病部位；C—病原菌在MYG平板25 ℃培養(yǎng)；D—病原菌顯微形態(tài)。圖1 病原菌形態(tài)特征

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，獲得供試菌株ITS序列片段，BLAST在線比對(duì)結(jié)果表明，JS-1與長(zhǎng)毛擬青霉Paecilomycespenicillatus(登錄號(hào)：EU146306.1)相似度為99.81%；與長(zhǎng)孢卵單隔孢霉Diplo?sporalongispora(登錄號(hào)：KX427537.1)相似度為99.44%。將致病菌的ITS序列與相近種菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，結(jié)果顯示，所得病原菌JS-1與長(zhǎng)毛擬青霉菌株及長(zhǎng)孢卵單隔孢霉聚于同一分支，說(shuō)明其親緣關(guān)系較近。

2.4 病原菌生物學(xué)特性

致病菌菌絲在不同培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。在Czapek培養(yǎng)基上，致病菌菌絲生長(zhǎng)速度最快，但中心菌絲濃密，邊緣菌絲稀疏；在MYG培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌落邊緣整齊，菌絲濃密；其次為PDA培養(yǎng)基；SDAY培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)最為緩慢。在菌絲生長(zhǎng)后期，可以觀察到培養(yǎng)基萎縮甚至穿孔。

致病菌菌絲在不同pH試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。羊肚菌致病菌菌絲在pH 5～9的條件下均可生長(zhǎng)，pH 6～8時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度較快，且致病菌菌絲在不同pH下差異并不顯著。

致病菌菌絲在22～34 ℃溫度范圍下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3，在25 ℃條件下培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌株菌絲生長(zhǎng)速度最快，其次為22 ℃，溫度高于31 ℃時(shí)，菌絲不生長(zhǎng)。因此，JS-1菌絲較適宜的生長(zhǎng)溫度為25 ℃。

碳源試驗(yàn)結(jié)果表明，致病菌株在不同碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)(表4)，但菌落形態(tài)及菌絲生長(zhǎng)速率不同。在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速率最快，為0.225 cm·d-1；其次為葡萄糖及淀粉，分別為0.205及0.201 cm·d-1。各培養(yǎng)基的菌絲密度差異較為顯著，其中淀粉為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最為濃密；以葡萄糖為碳源時(shí)，菌絲較為稀疏。因此，致病菌JS-1菌絲生長(zhǎng)較適宜碳源為乳糖。

圖2 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

表2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

表3 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

表4 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

氮源試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株在不同氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但氮源不同，菌絲體生長(zhǎng)速度及菌落形態(tài)差異較大(表5)。在以酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲體生長(zhǎng)速度最快，為0.312 cm·d-1，菌絲生長(zhǎng)濃密。其次為以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)速度為0.222 cm·d-1，但菌絲生長(zhǎng)稀疏。而在硫酸銨、磷酸氫二鉀為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲體生長(zhǎng)速度很慢，而且菌絲長(zhǎng)勢(shì)差。因此，致病菌JS-1菌絲體較適宜的氮源為酵母浸粉。

表5 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

3 討論

近年來(lái)，羊肚菌因其低投入高回報(bào)的特點(diǎn)在全國(guó)范圍內(nèi)種植面積大幅增加，對(duì)其致病菌進(jìn)行研究，對(duì)保證其品質(zhì)和產(chǎn)量有重要意義。目前，已有研究表明，多種病原菌可侵染羊肚菌子實(shí)體導(dǎo)致真菌病害發(fā)生。劉偉等[6]報(bào)道羊肚菌的真菌性病害主要有霉菌性枯萎病、蛛網(wǎng)病、鐮刀菌病。劉天海等[7]對(duì)四川等地暴發(fā)的柄腐病害進(jìn)行調(diào)查鑒定，結(jié)合菌落形態(tài)和顯微特征鑒定柄腐病的病原菌為Fusariumnematophilum，該病原菌菌落正面白色，背面米白色，不透明，隆起，菌絲致密，邊緣整齊，菌落呈同心環(huán)紋，菌絲有隔，有分枝，無(wú)水溶性色素，分生孢子呈鐮刀型，整體較粗壯，中部略寬于兩端，尖端短而小，大多3隔，極少數(shù)1隔、2隔或4隔，呈3隔孢子的隔間距7～12 μm。余苗等[8]對(duì)羊肚菌白腐病病菇進(jìn)行分離鑒定，采用形態(tài)學(xué)研究，結(jié)合ITS序列分析技術(shù)鑒定病原菌為曲霉(Aspergillussp.)，該病原真菌菌絲體顏色為白色，菌落邊緣整齊呈圓形，稍凸起，產(chǎn)生分生孢子后呈黃綠色，分生孢子球形、近球形。黃慧等[9]對(duì)貴州六盤(pán)水等地暴發(fā)的羊肚菌菌蓋干腐病進(jìn)行病原菌的分離鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)病原菌為長(zhǎng)孢卵單隔孢霉(D.longispora)，該致病菌菌落邊緣整齊、表面干燥，呈白色絨毛狀，有輪狀花紋，顯微形態(tài)下分生孢子梗透明，呈細(xì)長(zhǎng)棍棒狀，分生孢子鏈生，呈棍棒狀或長(zhǎng)檸檬形狀，有隔。

本研究分離得到的致病菌菌落初期為白色，輪狀生長(zhǎng)，邊緣規(guī)則，菌絲絨毛狀，較發(fā)達(dá)，后期菌絲生長(zhǎng)部位培養(yǎng)基萎縮，顯微形態(tài)下分生孢子梗側(cè)生，分生孢子鏈?zhǔn)剑环稚咦訔l形或梭形，有間隔。測(cè)序獲得的ITS序列經(jīng)NCBI比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與長(zhǎng)毛擬青霉相似度為99.81%；與長(zhǎng)孢卵單隔孢霉相似度為99.44%，進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明JS-1的ITS序列與長(zhǎng)毛擬青霉和長(zhǎng)孢卵單隔孢霉聚為一支，這兩者均為羊肚菌真菌病害的主要病原菌[10-11]。前人研究[12-13]結(jié)果表明，這2種真菌的分生孢子都呈鏈?zhǔn)剑L(zhǎng)毛擬青霉的分生孢子呈橢圓形或梨形，無(wú)隔；而長(zhǎng)孢卵單隔孢霉的分生孢子為棍棒狀或長(zhǎng)檸檬形，有隔。通過(guò)比對(duì)其形態(tài)學(xué)特征，本研究分離得到的致病菌在形態(tài)上更接近于長(zhǎng)孢卵單隔孢霉。因此，通過(guò)結(jié)合發(fā)病特征、形態(tài)學(xué)觀察及構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明該病害是由長(zhǎng)孢卵單隔孢霉(D.longispora)侵染引起的。

此外，生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，羊肚菌白霉病病菌最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，30 ℃以上不生長(zhǎng)，pH在6～9時(shí)生長(zhǎng)較快，說(shuō)明該菌不耐高溫，對(duì)pH適應(yīng)范圍較廣，與黃慧等[9]的研究結(jié)果一致；最適碳、氮源為乳糖及酵母浸粉。本研究通過(guò)對(duì)羊肚菌白霉病病原菌的鑒定，尤其是對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)特性研究，為進(jìn)一步研究該病害的發(fā)病規(guī)律及田間防治奠定理論基礎(chǔ)。