阿爾茨海默病患者血清miR-98-5p和miR-142-5p水平變化及其意義

何霞，衛仙洪，李佳，李玲，王建

1 雅安市人民醫院檢驗科，四川雅安 625000；2 雅安市人民醫院神經內科

阿爾茨海默病（AD）是一種以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的神經退行性疾病，是導致老年人失能的重要原因［1］。大多數學者認為，腦內大量β 淀粉樣蛋白（Aβ）沉積使小膠質細胞活化從而引起慢性神經炎癥，可能是AD發病的重要病理生理機制［2］。因此，抑制神經炎癥有可能成為防治AD的一個新途徑。微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA 分子，在生物體中可參與轉錄后的基因表達調控。近年研究表明，miRNA 在AD 的發生、發展中發揮重要作用［3］。miR-98-5p、miR-142-5p 是新近發現的miRNA分子。有研究報道，miR-98-5p在缺血性腦卒中患者腦組織中異常富集，并與神經炎癥密切相關［4］；而miR-142-5p與多發性硬化癥患者神經炎癥密切相關［5］。有研究通過分析AD 患者血液中miRNA表達譜發現，AD 患者血液中miR-98-5p、miR-142-5p水平顯著升高［6-7］。本研究探討了AD 患者血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平變化及其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年1月—2022年1月雅安市人民醫院收治的AD 患者103 例（觀察組）。AD診斷依據《2018 中國癡呆與認知障礙診治指南（二）：阿爾茨海默病診治指南》［8］。納入標準：①符合AD 診斷標準；②初診，入院前未接受任何AD 相關的治療；③臨床資料完整。排除標準：①近3個月內有急慢性感染者；②有攻擊行為或自殺傾向者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能不全者；④合并免疫系統或造血系統損害者；⑤合并顱腦損傷導致的認知功能障礙者；⑥合并嚴重軀體疾病或精神疾病者。其中，男63 例、女40 例，年齡53～87（66.54 ±5.87）歲，BMI 18.7～28.3（22.54 ± 1.98）kg/m2，文化程度：高中及以上49 例、初中及以下54 例。同期另選體檢健康的志愿者50 例（對照組），男31 例、女19 例，年齡32～82（65.18 ± 5.52）歲，BMI 19.7～27.4（22.18 ± 1.55）kg/m2，文化程度：高中及以上24 例、初中及以下26 例。兩組性別、年齡、BMI、文化程度具有可比性。本研究經雅安市人民醫院倫理委員會批準（審批文號：AW2214），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-98-5p、miR-142-5p 檢測 觀察組入院次日，對照組體檢當日，采集空腹外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min、離心半徑10 cm，取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol 法提取血清總RNA，經微量分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。按逆轉錄試劑盒說明將總RNA 逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行PCR 擴增。所有引物序列由新貝（上海）生物科技有限公司設計合成。miR-98-5p 上游引物5'-TGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTT-3'、下游引物5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'，miR-142-5p上游引物5'-AACCAAGACGCTCATGAAGAAG-3'、下游引物5'-CTGCGAGTAGGACATGCTGTAG-3'，內參U6 上游引物5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'、下游引物5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。PCR反應體系共20 μL：SYBR?Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL、50×ROX Ref?erence Dye 0.4 μL，RNase Free H2O 6 μL；反應條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s 共40 個循環。PCR擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-98-5p、miR-142-5p水平。

1.3 血清Aβ1-40、Aβ1-42檢測 觀察組入院次日、對照組體檢當日，采集空腹外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min、離心半徑10 cm，取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 法檢測血清Aβ1-40、Aβ1-42。試劑盒購自優利科（上海）生命科學有限公司。所有操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.4 認知功能評估 觀察組入院次日，對照組體檢當日，采用簡易精神狀態檢查量表（MMSE）評分評估認知功能。MMSE 包括6 個維度30 個條目，總分0～30分。MMSE評分越高，認知功能越好。

1.5 統計學方法 采用SPSS28.0 統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗；偏態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，結果比較采用U檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 或Spearman 相關分析法。診斷效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，曲線下面積（AUC）比較采用Hanley & McNeil 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-98-5p、miR-142-5p水平比較 見表1。

表1 兩組血清miR-98-5p、miR-142-5p水平比較

2.2 兩組血清Aβ1-40、Aβ1-42 水平和MMSE 評分比較 見表2。

表2 兩組血清Aβ1-40、Aβ1-42水平和MMSE評分比較

2.3 AD 患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平與血清β1-40、Aβ1-42水平和MMSE評分的關系 Pearson/Spearman 相關分析顯示，AD 患者血清miR-98-5p 水平與血清Aβ1-40 水平呈正相關關系（r=0.594，P＜0.05），與血清Aβ1-42 水平和MMSE 評分均呈負相關關系（r分別為-0.517、-0.618，P均＜0.05）；血清miR-142-5p 水平與血清Aβ1-40 水平呈正相關關系（r=0.562，P＜0.05），與血清Aβ1-42 水平和MMSE 評分均呈負相關關系（r分別為-0.574、-0.624，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-98-5p、miR-142-5p水平對AD的診斷價值 ROC 曲線分析顯示，血清miR-98-5p 水平診斷AD 的AUC為0.782（95%CI：0.709～0.845），其最佳截斷值為1.36，此時其診斷AD 的靈敏度為61.17%、特異度為94.00%；血清miR-142-5p水平診斷AD 的AUC為0.791（95%CI：0.718～0.852），其最佳截斷值為2.23，此時其診斷AD 的靈敏度為61.17%、特異度為92.00%；血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平聯合診斷AD 的AUC為0.887（95%CI：0.826～0.932），其診斷AD的靈敏度為77.67%、特異度為92.00%。血清miR-98-5p、miR-142-5p水平聯合診斷AD的AUC大于血清miR-98-5p、miR-142-5p水平單獨（Z分別為3.409、3.661，P均＜0.05）。見圖1。

圖1 血清miR-98-5p、miR-142-5p水平診斷AD的ROC曲線

3 討論

AD是老年人最常見的一種癡呆類型。據調查，2020年我國60歲以上人群中癡呆患者約有1 507萬例，其中AD 患者983 萬例［9］。盡管近年來全球研發出了多種AD 治療藥物，但迄今為止仍無特效藥物能夠延緩AD 病情進展，故早發現、早干預至關重要。在臨床上，AD的診斷較為復雜，包括病史采集、體格檢查、神經心理評估、影像學檢查等。但《2020中國阿爾茨海默病患者診療現狀調研報告》指出，我國55.83% AD患者在出現癥狀7個月以上才得以確診［10］。因此，亟需尋找新的早期診斷手段。

AD最主要的病理特征為Aβ沉積引起的神經炎癥、突觸丟失或功能障礙、氧化應激、神經原纖維纏結等。其中，Aβ 沉積引起的小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元等炎癥反應可能是AD 發病的重要病理生理機制［2］。Aβ是含有39～43個氨基酸的多肽。人體內Aβ 常見的亞型為Aβ1-40、Aβ1-42。有研究報道，血液中Aβ1-40 水平降低和Aβ1-42 水平升高能夠反映AD 患者腦內Aβ 沉積情況［11］。本研究結果顯示，觀察組血清Aβ1-40 水平降低、血清Aβ1-42水平升高，符合AD患者Aβ沉積這一病理變化。

miRNA 是一類非編碼RNA 分子，在生物體中可參與轉錄后的基因表達調控。近年研究表明，miRNA在AD 的發生、發展中發揮重要作用［3］。miR-98-5p、miR-142-5p 是新近發現的miRNA 分子。miR-98-5p基因定位于人染色體Xp11.22。ZHENG 等［12］研究報道，miR-98-5p 能夠靶向調控Toll 樣受體4/NF-κB信號通路參與內皮細胞炎癥。巫興陽等［13］研究報道，miR-98-5p與膿毒癥全身炎癥反應激活有關。結果表明，miR-98-5p 是一個與炎癥反應密切相關的miRNA。ZHOU 等［4］研究報道，miR-98-5p 在缺血性腦卒中患者腦組織中異常富集，并與神經炎癥密切相關。miR-142-5p基因定位于人17號染色體。既往研究報道，miR-142-5p是一個與腫瘤相關的miRNA。近年研究發現，miR-142-5p 還能參與炎癥反應。XU等［14］研究報道，miR-142-5p 能夠靶向細胞因子信號抑制劑1 激活NF-κB 信號通路，促進肝臟炎癥反應。在帕金森病模型中，抑制miR-142-5p能夠抑制NF-κB信號通路激活，進而抑制神經元炎癥［15］。結果表明，miR-142-5p也是一個與炎癥反應密切相關的miRNA，能夠參與神經炎癥反應。

本研究結果發現，觀察組血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平顯著高于對照組，與以往研究［6-7］報道一致。進一步分析發現，AD患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平與血清Aβ1-40水平均呈正相關關系，與血清Aβ1-42水平均呈負相關關系。提示AD患者血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平升高可能與腦內Aβ沉積有關，其機制可能與miR-98-5p 能夠抑制分選連接蛋白6表達和miR-142-5p能夠抑制非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1（PTPN1）有關。分選連接蛋白6可參與調控蛋白質運輸，通過調節β 分泌酶的內吞作用，影響淀粉樣蛋白前體蛋白的β加工，從而抑制Aβ 沉積［16］。有研究表明，下調miR-98-5p 能夠通過上調分選連接蛋白6 抑制Aβ 沉積［17］。PTPN1 是一種蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白，能夠通過滅活糖原合成酶激酶3抑制Aβ沉積。有研究報道，下調miR-142-5p能夠靶向上調PTPN1 抑制AD 大鼠腦內Aβ 沉積和神經炎癥［18］。認知功能損害是AD 患者常見的臨床表現。MMSE 是臨床評估AD 患者認知功能的常用量表［1］。本研究結果發現，觀察組MMSE 評分顯著低于對照組，提示AD 患者存在明顯的認知功能損害。進一步分析發現，AD患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平與MMSE 評分均呈負相關關系。提示血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平升高與AD 患者認知功能降低有關，其原因與miR-98-5p、miR-142-5p 能夠參與AD患者腦內Aβ沉積有關。

本研究ROC 曲線分析顯示，血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平單獨和聯合診斷AD 的AUC分別為0.782、0.791、0.887，血清miR-98-5p、miR-142-5p 水平聯合診斷AD 的AUC高于血清miR-98-5p、miR-142-5p水平單獨。提示miR-98-5p、miR-142-5p可作為診斷AD 的血清生物標志物，二者聯合能夠提高其診斷價值。

綜上所述，AD 患者血清miR-98-5p、miR-142-5p水平顯著升高，其水平升高與Aβ 沉積和認知功能降低密切相關；miR-98-5p、miR-142-5p 有可能成為診斷AD的血清生物標志物。