長沙市某雞場混合感染禽白血病與馬立克氏病毒的分子診斷

譚 丹，陳 智，鄒建曾，劉增再，鄭姣妹，唐愛明，王文梅，耿相昌，賴詩嘉周元中，寧華杰，黃 甜，王洪亮*

（1.長沙市動植物疫病預防控制中心，湖南長沙 410000；2.長沙市農業綜合行政執法局，湖南長沙 410000；3.寧鄉市動植物疫病預防控制中心，湖南寧鄉 410600；4.瀏陽市佳和養殖專業合作社，湖南瀏陽 410300）

目前，在我國引起家禽傳染性腫瘤病主要有3種，即皰疹病毒引起的馬立克氏病（Marek′s disease，MD)，網狀內皮組織增生病毒引起的網狀內皮組織增生癥（Reticuloendotheliosis，RE)和禽白血病毒引起禽白血病（avian leukosis，AL)。現AL 和MD 在雞群中較為常見，在我國雖然MD 疫苗的使用具有一定保護性，但近年來國內出現接種疫苗，雞群依然發病的情況時有發生，尤其多病原的混合感染造成雞生長抑制、產蛋性能下降、出現免疫抑制現象，甚至引發雞群產生腫瘤和死亡等，給養雞業造成了巨大損失。該文主要對長沙市某發病雞群進行了ALV 和MDV 混合感染確診和鑒定，并對ALV 的env 和MDV-meq 基因進行序列分析，豐富長沙市關于禽病的分子流行病學數據，為長沙市禽白血病和馬立克氏病的凈化與防治提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料來源于2020 年長沙市某養雞場，檢測為AIV 和MDV 感染陽性，采集發病和死亡雞的組織病料及血清。經調查，該發病雞群存欄2000 羽，170 日齡左右，發病雞肉冠發白，消瘦、精神不良，翅膀下垂，排綠色稀薄糞便等臨床癥狀，發病雞陸續發生死亡，日死亡率為0.4%～2%。病死剖檢可見全身內臟器官均出現腫大，尤其是肝臟、脾臟及腎臟，出現不同程度的腫瘤結節。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司、一步法RT-PCR 試劑盒購自天根生化科技（北京)有限公司、AIVH5/H7 雙熒光核酸檢測試劑盒、傳染性法氏囊病核酸檢測試劑盒、禽網狀內皮增生癥核酸檢測試劑盒、禽白血病核酸檢測試劑盒、馬立克氏病核酸檢測試劑盒5 種試劑盒均購自達安基因公司，引物由通用生物系統（安徽)有限公司合成（見表1)。

1.3 引物合成

用于測定ALV-env 基因、MDV-meq 基因的引物主要引用于參考文獻[1，2]，引物序列見表1。

1.4 病毒鑒定與目的基因擴增及測序

結合雞群的臨床和剖檢變化，初步懷疑為白血病和馬立克氏病毒感染，對病死雞的病料組織用病毒DNA/RNA 提取試劑盒進行核酸提取，核酸-80℃保存備用，取核酸分別加入禽流感、傳染性法氏囊病、禽網狀內皮增生癥、禽白血病、馬立克氏病的特異性引物進行檢測，擴增體系分別按照AIVH5/H7 雙熒光核酸檢測試劑盒、傳染性法氏囊病核酸檢測試劑盒、禽網狀內皮增生癥核酸檢測試劑盒、禽白血病核酸檢測試劑盒、馬立克氏病核酸檢測試劑盒5 種試劑盒說明書進行熒光定量PCR 檢測。

目的基因擴增：取5μL 核酸配制PCR 檢測體系分別添加ALV-env 基因、MDV-meq 基因擴增引物進行基因擴增，ALV-env 基因擴增反應程序為：42℃30min；94℃ 5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃3min，35 個循環；72℃10min。MDV-meq 基因擴增反應程序：42℃30min；94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃1min，35 個循環；72℃10min。將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定為目的條帶后送至通用生物系統（安徽)有限公司進行序列測定。

1.5 序列分析

對測序公司獲得的序列在NCBI 網站上對所測毒株進行BLAST 比對，同時利用MEGA5.0、DNAStar進行基因序列分析并繪制進化樹。

2 結果與分析

2.1 病毒鑒定結果

經檢測，馬立克氏病、禽白血病核酸檢測為陽性，結果見圖1、圖2，其他疫病檢測均為陰性，將毒株命名為ALV-2010HUNAN，MDV-2010HUNAN。

圖1 禽白血病毒核酸熒光PCR 檢測結果

圖2 馬立克氏病毒核酸熒光PCR 檢測結果

2.2 ALV env 基因序列及遺傳進化分析

對擴增的ALV-env 基因序列測定后，下載參考序列進行比對分析，發現該文分離毒株env 基因序列與內源性E-ALV 代表毒株同源性最高為98.9%，與A-D群ALV 毒株同源性為81%～89.2%，與J 群ALV 毒株同源性最低為33.01%～40.5%。進化樹顯示，該毒株與內源性ALV 處于同一進化枝，判定該毒株為內源性ALV（圖3)。

圖3 分離毒株與參考毒株env 基因遺傳進化樹

2.3 MDV meq 基因序列及遺傳進化分析

對擴增的MDV-meq 基因序列測定后，下載參考序列進行比對分析，發現分離株MDV-2010HUNAN的meq 序列與參考野毒GX0101 和疫苗毒CVI19898相比，在提供的meq 序列中不含有CVI988 特有的插入，因此判定所提供的序列為MDV 野毒。進一步對序列同源性和遺傳進化關系進行分析，發現該毒株與我國MDV 野毒株處于同一進化分支，同源性為96.5%～99.2%（詳見圖4-圖5)。

圖4 分離毒株與參考毒株meq 基因同源性比較

圖5 分離毒株與參考毒株meq 基因遺傳進化樹

3 討論

根據本次雞群發病的臨床癥狀、病原學檢測及病毒基因序列測定結果顯示，引起本次雞群發病死亡的主要原因為馬立克氏野毒和E 群禽白血病毒混合感染所致。從我們所測得ALV-env 基因比對分析該毒株為E 群屬于內源性病毒，據報道，ALV-env 基因是ALV引發雞體產生腫瘤的主要基因之一，可根據核苷酸同源性比對來鑒定分離株的亞群[3]，本次分離毒株雖然為內源性毒株，但雞場感染ALV 后會引起雞群的免疫抑制，一旦MDV 野毒進入，兩種病毒共同感染，會迅速增加病毒對雞群的感染性和致病力，從而引起雞群的嚴重的免疫抑制及腫瘤癥狀[4]。

meq 是MDV 原癌基因，參與腫瘤形成及免疫抑制[5]，本次分離的毒株meq 序列同源性和遺傳進化關系進行分析，發現該毒株與我國MDV 我國流行野毒株處于同一進化分支，與國內強毒株GX0101 代表毒株同源性97.2%，處于同一大分支，很可能分離毒株為流行的強毒株，其具體致病性和致病型如何還有待進一步研究。

目前該類群ALV 尚無疫苗和藥物進行防治，各地主要通過種禽場的凈化和生物安全措施進行防控，長沙市2020 年以來嘗試對培育的瀏黃雞等地方品種進行流調及禽白血病凈化工作，雖然有些成效，但是還是存在零散發生。而MDV 的防控主要通過接種疫苗，疫苗主要有單價苗、二價苗、三價苗及重組DNA 疫苗4 大類[6]，雖然疫苗免疫能抵御一般毒株的侵襲，但有研究發現，部分MDV 的超強毒株及特超強毒株能突破疫苗免疫保護[7]，或者與其他免疫抑制性病毒的混合感染降低了雞群對MD 疫苗的免疫應答效果，增加感染MDV 的幾率，引起MDV 在雞群的暴發。因此建議一是做好種雞群凈化，可在產蛋前經ELISA 或其他血清學檢測，陽性雞一次性淘汰，經三四代淘汰后，雞群達到凈化；二是做好疫苗免疫，嚴格按照免疫程序做好MD 及常規疫苗的免疫；三是加強飼養管理，保持良好養殖環境衛生，做好雞舍、放養區及飼養用具等消毒工作，消毒藥建議交替使用，同時做好球蟲等驅蟲工作。

4 結論

該文對采集病雞組織病料進行病原的鑒定及重要基因的測序分析，表明此次病原主要是禽白血病病毒和馬立克氏病毒混合感染，進一步序列分析ALV env 基因與內源性ALV 處于同一進化分支，MDV-meq 基因與我國MDV 野毒株處于同一進化分支，進一步說明該雞群為MDV 野毒株和內源性ALV 的混合感染導致，建議后期雞場在種源凈化、疫苗免疫及生產管理方面做好禽白血病及馬立克氏等疫病防控。