血清環狀FoxO3a在宮頸鱗癌患者中的 表達及其臨床意義

陳 婷

（張家港市第一人民醫院婦產科，江蘇 蘇州 215600）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其早期癥狀主要是局限于宮頸，還沒有向周圍其他組織蔓延，因此患者往往沒有明顯癥狀，隨著腫瘤的增大，壓迫和侵犯臨近器官組織才會出現相應癥狀，并嚴重威脅女性的健康和生命。宮頸癌病理類型有鱗狀細胞癌、腺癌等，以宮頸鱗狀細胞癌（squamous cervical cancer， SCC）最為常見[1]。宮頸癌的早期篩查，可以及時發現癌變細胞并進行治療，能夠提高患者預后效果。鱗狀細胞癌抗原（SCC-Ag）是目前最常用的鱗狀細胞癌標志物，在肺癌、食管癌及頭頸部腫瘤中被證實可用于評估腫瘤的惡性程度，預測患者的生存預后，但是SCC-Ag的特異性較差[2]，因此迫切需要探索新的無創血清生物標志物，以更準確地預測SCC患者的預后。非編碼RNA是真核生物體內廣泛存在的一類能夠調控遺傳物質正常轉錄和翻譯表達的小分子物質，在多種疾病包括惡性腫瘤、心腦血管疾病及正常組織發育和分化過程中扮演重要角色。圓形叉頭盒O3a（FoxO3a）被證實是一種重要的腫瘤抑制因子，在多種惡性腫瘤組織中表達下調，并且參與細胞增殖和細胞周期；同時，也有研究表示FoxO3a可以作為非小細胞肺癌患者的早期診斷、治療監測及預后的標志物[3-4]。本研究旨在探討SCC患者血清環狀FoxO3a與腫瘤病理特征的關系，及其對預測患者預后的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年5月至2020年5月張家港市第一人民醫院收治的98例SCC患者（SCC組）的臨床資料，另回顧性分析30例宮頸上皮內瘤變患者（瘤變組）和30例健康體檢志愿者（健康組）的臨床資料。其中健康組研究對象年齡45～74歲，平均（56.5±7.1）歲；瘤變組患者年齡46～73歲，平均（55.8±6.7）歲；SCC組患者年齡44～76歲，平均（57.6±7.3）歲。3組研究對象年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），組間具有可比性。納入標準：SCC組患者符合《宮頸癌及癌前病變規范化診療指南（試行）》[5]中的相關診斷標準，宮頸活檢及術后病理診斷為宮頸鱗狀細胞癌；瘤變組患者符合《婦產科學》[6]中的相關診斷標準；術前無放化療及其他干預性治療者；患者臨床資料完整等。排除標準：入組前6個月內存在宮頸病變并接受過治療者；合并其他部位原發惡性腫瘤者；嚴重肝、腎功能障礙或自身免疫性疾病者等。本研究經過院內醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法 ①采集所有研究對象外周靜脈血10 mL于抗凝管中，根據檢測試劑盒（美國Invitrogen公司）提示步驟依次完成血清分離、冷凍、復蘇及提純等，采用超微量分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Nano-Drop-2000）測定核糖核酸（RNA）濃度。收集RNA（2 μg）在37 °C和3 U/μg RNase R（上海震中生物技術有限公司）孵育15 min去除線性RNA，純化環狀FoxO3a；然后使用實時熒光定量PCR系統（美國賽默飛世爾abi公司，型號：7500 Fast Real-Time PCR）和SYBR Green熒光定量PCR試劑盒（中國大連Takara有限公司）進行逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）。引物購自中國上海桑光生物科技有限公司，序列為：FoxO3a（F）5'-ATTGCCAGAGAGGCCGCGCGG-3'，（R）5'-GTGGAACTGGTGCTAG-3'；GAPDH（F）5'-GTCTCCTGTCAGCGCGCGAG-3'，（R）5'-ACCCTTGTCAGCA-3'。根據擴增試劑盒提示配置恰當的反應體系和設置擴增參數，結束后電泳進行產物鑒定。以GAPDH為內參，用2-ΔΔCt法計算FoxO3a的相對表達量。②采用受試者工作特征（ROC）曲線分析FoxO3a對SCC患者預后的診斷價值。③以ROC曲線最佳截斷值0.23為臨界值，將患者劃分為高FoxO3a組（58例，FoxO3a≥ 0.23）與低FoxO3a組（40例，FoxO3a＜0.23），對比分析高FoxO3a組和低FoxO3a組患者的臨床資料。臨床資料主要包括年齡（＜58歲、≥ 58歲）、TNM分期（Ⅰ ～ Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期）、腫瘤直徑（≤ 4 cm、＞4 cm）、淋巴血管侵犯（陰性、陽性）、間質浸潤深度（＜1/2、≥ 1/2）、淋巴結轉移（陰性、陽性）。④所有患者均進行隨訪追蹤至死亡日期或術后5.0～26.0個月，隨訪方式為電話或門診，頻率為1次/3個月，記錄患者術后的生存情況，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并行Log-rank檢驗進行生存分析。⑤采用Cox比例風險模型分析影響SCC患者術后預后的相關因素。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據，計量資料均符合正態分布且方差齊，以(±s)表示，行t檢驗；計數資料以[例(%)]表示，采用χ2檢驗；采用ROC曲線分析FoxO3a對SCC患者術后預后的診斷價值；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，行Log-rankχ2檢驗；采用Cox比例風險模型分析影響SCC患者術后預后的相關因素。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組研究對象血清FoxO3a相對表達量比較 健康組、瘤變組、SCC組研究對象FoxO3a相對表達量分別為（0.89±0.09）、（0.90±0.11）、（0.44±0.08），SCC組顯著低于健康組、瘤變組，差異均有統計學意義（t=26.170、25.104，均P＜0.05），但健康組、瘤變組研究對象血清FoxO3a相對表達量比較，差異無統計學意義（t=0.385，P＞0.05）。

2.2 FoxO3a預測SCC患者預后的ROC曲線 所有患者隨訪5.0～26.0個月，中位時間18.5個月，隨訪期間SCC組患者中死亡10例，死亡率為10.2%（10/98）；ROC曲線分析顯示，FoxO3a預測SCC患者預后的AUC值為0.856（95%CI：0.798～0.899），差異有統計學意義（P＜0.05），敏感度為81.20%，特異性為73.60%，最佳截斷值為0.23，見圖1。死亡患者、生存患者血清FoxO3a相對表達量分別為（0.18±0.02）、（0.62±0.11），死亡患者血清FoxO3a相對表達量顯著低于生存患者，差異有統計學意義（t=12.570，P＜0.05）。

圖1 FoxO3a預測SCC患者預后的ROC曲線

2.3 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者臨床資料比較 低FoxO3a組中Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑＞4 cm、淋巴血管侵犯陽性、間質浸潤深度≥ 1/2、淋巴結轉移陽性的患者占比均顯著高于高FoxO3a組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者 臨床資料比較[例(%)]

2.4 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者Kaplan-Meier生存曲線分析 低FoxO3a組累積生存率顯著低于高FoxO3a組，差異有統計學意義（Log-rankχ2=5.659，P＜0.05），見圖2。

圖2 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者 Kaplan-Meier生存曲線圖

2.5 影響SCC患者預后的Cox比例風險模型分析 單因素和多因素Cox分析結果顯示，淋巴血管侵犯陽性、間質浸潤深度≥ 1/2、淋巴結轉移陽性、FoxO3a＜0.23均是影響SCC患者預后的危險因素，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 影響SCC患者預后的Cox比例風險模型分析

3 討論

SCC是宮頸癌的一種病理類型，腫瘤來源于宮頸鱗狀上皮細胞，如果腫瘤分化程度比較低，可以看到角化珠和組織間橋的話，則異型性比較低，細胞的倍增時間也比較長，發展速度也就相對慢一些。宮頸癌鱗癌的患者需要接受以手術治療為主、放化療為輔助的綜合性治療，手術切除范圍需要根據腫瘤的大小和侵犯范圍來決定，晚期患者預后較差，因此早期發現并進行治療，預后效果更好。

環狀RNA是新近發現的一種非編碼RNA，可通過miRNA海綿樣效應或與蛋白相互作用在乳腺癌、肝細胞癌、結直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發生和侵襲轉移過程中發揮重要作用[7-8]。FoxO3是著名的轉錄因子家族成員，通常以抑癌作用為主，腫瘤組織高表達FoxO3a患者預后通常較好[9]。本研究結果發現，SCC組患者血清FoxO3a相對表達量顯著低于健康組、瘤變組，SCC組中死亡患者血清FoxO3a相對表達量顯著低于生存患者，提示SCC患者血清FoxO3a相對表達量同樣呈現低表達，并且死亡患者表達更低。TIAN等[10]研究指出，低表達FOXO3a與宮頸癌預后不良相關，并通過WNT/β-catenin信號通路促進細胞侵襲和遷移等行為。本研究中，ROC曲線分析顯示，FoxO3a預測SCC患者預后的AUC值為0.856，敏感度為81.20%，特異性為73.60%，最佳截斷值為0.23；低FoxO3a組中Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑＞4 cm、淋巴血管侵犯陽性、間質浸潤深度≥ 1/2、淋巴結轉移陽性的患者占比均顯著高于高FoxO3a組，提示FoxO3a相對表達量與SCC患者預后密切相關。FoxO3a是FOXM1轉錄因子的上游調節基因，也是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路的重要下游效應物，FOXM1/FoxO3a信號通路可以通過調節腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、血管生成來控制惡性腫瘤的嚴重程度，也可影響腫瘤的病理 特征[11]。

本研究中，單因素和多因素Cox分析結果顯示，淋巴血管侵犯陽性、間質浸潤深度≥ 1/2、淋巴結轉移陽性、FoxO3a＜0.23均是影響SCC患者預后的危險因素，可見FoxO3a＜0.23與SCC患者預后不良密切相關。無論是腫瘤TNM分期升高、腫瘤直徑增大、淋巴血管侵犯陽性、間質浸潤深度增加，還是淋巴結轉移陽性均提示腫瘤惡性程度較高，均出現血清FoxO3a相對表達量降低，也說明FoxO3a表達下調后釋放入血濃度降低，發揮抑癌效應減弱，進而出現腫瘤惡性侵襲。FOXO3a是一種重要的蛋白質轉錄調節因子，廣泛參與多種生物學過程，包括增殖、細胞周期調節、存活、凋亡及自噬等，同時還與氧化應激、DNA損傷相關[12]。FOXO3a是PI3K/AKT信號通路的重要下游信號傳導分子之一，當PI3K/AKT信號通路被激活時，AKT被磷酸化，活化的AKT可使其下游信號傳導分子FOXO3a的3個磷酸化位點被磷酸化，磷酸化的FOXO3a轉錄因子與胞核內結構蛋白特異性結合，使FOXO3a從細胞核內移入細胞質中，抑制FOXO3a的轉錄活性，從而促進腫瘤細胞增殖、分化，加重SCC患者病情，不利于預后 恢復[13]。

綜上，術前FoxO3a相對表達量與SCC患者術后預后密切相關，其對SCC患者術后預后評估亦具有較高的預測價值，且淋巴血管侵犯陽性、間質浸潤深度≥ 1/2、淋巴結轉移陽性、FoxO3a＜0.23均是SCC患者術后預后不良的危險因素。但研究不足是樣本量較小，隨訪時間較短，可能出現選擇性偏倚和統計誤差。