黃芪多糖與丹酚酸 B 配伍對 TGF-β1 誘導的肺上皮細胞間質轉化的影響

李晗 宋玲 高云航 陳騰飛 侯紅平 葉祖光 張廣平

肺纖維化是由多種因素所致嚴重的肺間質慢性疾病,為眾多肺部疾病的最終表現結果。 該病早期以下呼吸道急性炎癥反應為主,后期發展為成纖維細胞過度增殖與細胞外基質(extracellular matrixc,ECM)過量沉積,最終導致呼吸衰竭。 肺纖維化成因復雜,具體發病機制尚未完全闡明,因此該疾病也成為呼吸系統最嚴重疾病之一[1]。 當前研究發現肺泡上皮—間質轉化( epithelialmesenchymal transition,EMT)是纖維化形成中的關鍵,因此有學者認為抑制EMT 是預防纖維化的有效手段[2-3]。 轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是 EMT 過程的總開關,其可促進間質細胞的增殖和分化,促進ECM 的沉積,因此其被認為是最重要的致纖維化因子[4]。

迄今,臨床治療肺纖維化多選用吡非尼酮、尼達尼布和糖皮質激,該藥物雖能改善肺部炎癥的發生與延緩纖維化進展,但均伴有嚴重的胃腸道副作用[5]。 如何利用傳統中醫理論和中藥來治療肺纖維化,已經成為科研人員關注的熱點。 在中醫古籍中并無“肺纖維化”的記載,但根據其臨床癥狀,多將其歸屬于“肺痿”與“肺痹”的范疇,且病機主要為“氣虛血瘀”,基本治療方法則多采用益氣活血法,選用黃芪丹參相伍,益氣活血,補而不滯。 同時,本課題組前期發現,黃芪多糖(astragalus polysaccharides, APS) 與 丹 酚 酸 B(salvianolic acid B,Sal B)配伍具有改善博來霉素致大鼠肺纖維化的作用,且丹酚酸對TGF-β1 誘導的EMT 具有抑制作用[6]。 因此本研究在前期已確定黃芪多糖與丹酚酸B 具有抗PF 藥效作用基礎上,以人肺泡上皮細胞株A549 為研究對象,進一步揭示黃芪多糖與丹酚酸B 配伍對TGF-β1 誘導的肺上皮細胞間質轉化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肺泡上皮細胞A549 細胞株,購于北京協和醫院研究所細胞庫。

1.2 藥物與試劑

黃芪多糖(上海赫澎科技生物公司,批號:HPBIO-B549);丹酚酸B(成都曼思特科技生物公司,批號:MUST-18070503);TGF-β1 人重組蛋白(美國Peprotech 公司,批號:081735);二甲基亞砜(美國Sigma 公司);1640 培養基(美國 Gibco 公司,批號:8119258);FBS 胎牛血清(美國 Gibco 公司,批號:2019-05-07);胰蛋白酶(上海Sangon Biotech 公司,批號:T1350);MTS 細胞存活率試劑盒(美國Promega 公司,批號:0000352619);人源纖連蛋白和人I 型膠原蛋白酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢華美生物科技有限公司,批號:J05037340、J23037588);RNA 提取試劑盒(北京天根生物有限公司,批號:U9019);反轉錄與real time PCR 試劑盒(北京全式金公司,批號:51219);Western blot 凝膠電泳配制試劑盒與BCA 蛋白定量試劑盒(北京康為世紀公司,批號:40415);一抗E-Cadherin 抗體(美國 Cell Signaling Technology 公司,批號:14472S),一抗α-SMA 抗體和Vimentin 抗體(英國Abcam 公司,批號: GR282976-35、 GR3186827-26); 二 抗 HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG 抗體(上海碧云天生物技術有限公司,批號:A2016);其他化學與生物試劑均為國產分析純。

1.3 主要實驗儀器

二氧化碳培養箱(美國 Thermo 公司);Eppendorf5810R 型臺式高速離心機(德國Eppendorf公司);CKX53 型倒置顯微鏡(日本Olympus 公司);SpectraMax i3x 型多標記酶標儀(美國 Molecular Devices 公司);Western blot 垂直電泳槽(美國 Bio-Rad);Western blot 轉膜儀(美國 Bio-Rad 公司);SCILOGEX 180-E 水平搖床(杭州奧盛儀器有限公司);凝膠成像儀(美國GE 公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養 取凍存于-80℃低溫冰箱的人肺泡上皮A549 細胞,快速轉移至37℃水浴鍋中進行解凍,生長在含有10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素—鏈霉素、1%非必需氨基酸的1640 培養基中,于37℃,5% CO2飽和濕度的條件下貼壁培養,待細胞匯合至80%時,按1 ∶3 的比例傳代,取對數生長期的細胞用于實驗。

1.4.2 細胞活力測定(MTS)法篩選出黃芪多糖與丹酚酸B 單用的安全濃度 待A549 細胞培養至對數期時,將該細胞以2×104個/孔細胞的密度接種于透明96 孔板,常規培養24 小時后,顯微鏡下觀察,待細胞融合至80%時,換成無血清培養基,饑餓處理12 小時。 實驗分為空白組、黃芪多糖組(10、20、40、60、80 mg/L)、丹酚酸 B 組(10、20、40、60、80 mg/L),每組設3 個復孔。 確定安全濃度后培養24、48 小時后,向 96 孔板中加入 20 μL/孔的 MTS,放置37℃,5% CO2 培養箱中避光孵育2 小時,孵育完畢后,利用酶標儀測定波長為490 nm 處的吸光度OD 值。

1.4.3 MTS 法篩選出黃芪多糖與丹酚酸B 配伍的安全濃度 待A549 細胞培養至對數期時,將該細胞以2×104個/孔細胞的密度接種于透明96 孔板,常規培養24 小時后,顯微鏡下觀察,待細胞融合至80%時,換成無血清培養基,饑餓處理12 小時。 實驗分為空白組、黃芪多糖組(60 mg/L APS)、丹酚酸B 組(60 mg/L Sal B)、配伍組(60 mg/L APS + 60 mg/L Sal B),每組設 3 個復孔。 培養 24、48 小時后,向96 孔板中加入20 μL/孔的 MTS,放置37℃,5% CO2培養箱中避光孵育2 小時,孵育完畢后,利用酶標儀測定波長為490 nm 處的吸光度OD 值。

1.5 檢測指標

1.5.1 MTS 法檢測芪多糖與丹酚酸B 配伍對TGF-β1誘導的肺上皮細胞增殖的影響 取對數生長期的A549 細胞,以 2×104個/孔細胞密度接種于 96 孔板,培養24 小時后于光鏡下觀察,細胞狀態穩定、貼壁生長及增殖狀態正常。 在前期實驗篩選出對A549 細胞無增殖抑制的濃度范圍下,將細胞分為空白組、模型組(5 μg/mL TGF-β1)[7]、丹酚酸 B 組(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B)、黃芪多糖組(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L APS)、配伍組(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B+60 mg/L APS)每組設3個復孔。 培養 24、48 小時后,向 96 孔板中加入20 μL/孔的MTS,放置37℃,5% CO2培養箱中避光孵育2 小時,酶標儀測定波長為490 nm 處的吸光度OD 值。

1.5.2 實時熒光定量PCR 法(real-time PCR,RTPCR)檢測 E-鈣黏蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(vimentin,Vim)的轉錄水平 將對數生長期的A549 細胞以細胞數3×105/孔接種于6 孔板中,將細胞分為空白組、模型組(5 μg/mL TGF-β1)、丹酚酸 B 組(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B)、黃芪多糖組(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L APS)、配伍組(5 μg/mL TGF-β1+60 mg/L Sal B+60 mg/L APS),藥物處理24 小時后,消化離心得到細胞,每個EP管中加入Trizol 提取細胞總RNA,用紫外分光光度計檢測RNA 濃度和純度(OD260/OD280 的值為1.8 ~2.0)。 取總 RNA 1 000 ng,按照說明書將總RNA 逆轉錄成cDNA 后進行RT-PCR 檢測,檢測采用Syber Green 法,PCR 反應條件為預變性94℃ 20秒,循環時94℃ 5 秒,60℃ 15 秒,72℃ 10 秒,共40個循環,最終所得數據以 2-(ΔCt實驗對照組-ΔCt空白對照組)值表示各目標基因mRNA 相對表達水平,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.3 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測E-Cad、α-SMA 和Vim 的蛋白表達 將對數生長期的A549細胞以3×105個/孔的密度接種于6 孔板中,待細胞融合至80%時,分組及加藥同“1.5.2”項。 培養24小時后,胰酶消化離心法收集細胞,每個EP 管中加入含蛋白酶抑制劑的裂解液100 μL 提取全蛋白。加入裂解液后,將EP 管置于冰浴中裂解30 分鐘,反復吹打,12 000 r/分鐘、4℃條件下離心10 分鐘,即得到蛋白。 BCA 法測定蛋白濃度,將蛋白加入loading buffer 后,于 100℃、10 分鐘條件下變性,50 μg蛋白經8%SDS-PAGE 電泳后分離,切膠后,將蛋白電轉移至PVDF 膜,室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 小時,并孵育 E-Cad(1 ∶1 000)、Vim(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶1 000)與 GAPDH(1 ∶1 000)的一抗,4℃封閉過夜,TBST 洗膜3 次,孵育二抗(1 ∶1 000),置于搖床上室溫孵育1 小時,TBST 洗膜3 次,加入ECL避光顯色,顯影后利用凝膠成像系統拍照記錄,并用Image J 軟件計算灰度值,以目的蛋白與GAPDH 蛋白灰度值的比值作為各組蛋白表達的相對含量。

1.5.4 酶聯免疫吸附法檢測纖連蛋白(fibronectin,FN)和I 型膠原蛋白(collagen-I,Col-I)的含量 將對數生長期的A549 細胞以3×105個/孔接種于6 孔板,待細胞融合至80%時,分組及加藥同“1.5.2”項。 加藥后細胞放置于37℃,5% CO2培養箱中培養24 小時后,收集細胞培養液,并于4℃,3 000 r/分鐘離心15 分鐘以去除培養液中的細胞碎片及雜質,取上清。 采用BCA 法測定蛋白總濃度,按照試劑盒說明書,按照FN 和Col-I 酶聯免疫檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.6 統計學處理

實驗所得數據為計量資料,采用SPSS 20.0 統計軟件進行分析,經檢驗所有數據符合正態分布且方差齊,以均數±標準差()表示。 組間比較采用單因素方差分析(one way-ANOVA),兩兩比較采用LSD 法,P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MTS 法篩選黃芪多糖與丹酚酸B 單用對A549細胞活性無影響的藥物濃度

與空白組比較,培養48 小時后,黃芪多糖80 mg/L與丹酚酸B 80 mg/L 對A549 細胞的增殖抑制作用顯著(P<0.01),見表2、3。 因此本實驗選擇丹酚酸B 60 mg/L 與黃芪多糖60 mg/L 進行后續實驗。

表2 不同濃度黃芪多糖對A549 細胞增殖的影響(,n=3)

表2 不同濃度黃芪多糖對A549 細胞增殖的影響(,n=3)

注: 與空白組比較,aP<0.05。

- 0.67±0.02 1.09±0.02黃芪多糖組 80 0.70±0.03 0.37±0.02a 60 0.60±0.01 1.05±0.02 40 0.70±0.02 1.17±0.05 20 0.67±0.02 1.25±0.02小時空白組組別 濃度(mg/L) 24 小時 48 10 0.68±0.02 1.24±0.03

2.2 MTS 法篩選黃芪多糖、丹酚酸 B 及配伍對A549 細胞活性無影響的藥物濃度

與空白組比較,黃芪多糖60 mg/L、丹酚酸 B 60 mg/L及其配伍組的細胞活性無顯著性差異。 見表4。

表3 不同濃度丹酚酸B 對A549 細胞增殖的影響(,n=3)

表3 不同濃度丹酚酸B 對A549 細胞增殖的影響(,n=3)

注: 與空白組比較,aP<0.05。

組別 濃度(mg/L) 24 小時 48- 0.68±0.02 1.19±0.02丹酚酸 B 組 80 0.63±0.01 0.60±0.01a 60 0.88±0.02 1.50±0.10 40 0.88±0.06 1.48±0.12 20 0.80±0.05 1.40±0.09小時空白組10 0.67±0.04 1.29±0.02

表4 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對A549 細胞增殖的影響(,n=3)

表4 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對A549 細胞增殖的影響(,n=3)

1.04±0.03 2.02±0.07黃芪多糖組 1.06±0.04 2.18±0.16丹酚酸 B 組 1.09±0.04 2.03±0.07配伍組小時空白組組別 24 小時 48 1.10±0.11 2.13±0.02

2.3 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞增殖的影響

與空白組比較,模型組在培養24、48 小時后細胞增殖出現抑制現象(P<0.01);與模型組比,培養24、48 小時后丹酚酸B 組和配伍組對細胞增殖抑制作用明顯(P<0.05)。 見表5。

表5 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞增殖抑制作用(,n=3)

表5 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞增殖抑制作用(,n=3)

注: 與空白組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05。

1.06±0.02 2.16±0.03模型組 0.88±0.02b 1.61±0.04a黃芪多糖組 0.89±0.03 1.69±0.04丹酚酸 B 組 0.61±0.03c 1.39±0.04c配伍組 0.68±0.03c 1.20±0.17小時空白組組別 24 小時 48 c

2.4 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞 E-Cad、Vim 和 α-SMA 的 mRNA 轉錄水平的影響

與空白組比較,模型組E-Cad mRNA 轉錄水平顯著性下調(P<0.01),Vim mRNA 轉錄水平顯著性上調(P<0.05)。 與模型組比較,黃芪多糖組、丹酚酸B 組和配伍組細胞E-Cad 的mRNA 轉錄水平顯著性上調(P<0.01),同時三組均下調了Vim 和α-SMA mRNA 轉錄水平(P<0.05)。 見表 6。

表6 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA mRNA 轉錄水平的影響(,n=3)

表6 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA mRNA 轉錄水平的影響(,n=3)

注: 與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01。

1.00±0.14 1.00±0.13 1.00±0.13模型組 0.35±0.08a 2.24±0.11a 1.12±0.01黃芪多糖組 0.43±0.07c 1.57±0.03b 0.95±0.03b丹酚酸 B 組 0.52±0.03c 2.08±0.05b 0.39±0.01b配伍組 0.74±0.06c 1.31±0.05b 0.52±0.06-SMA/GAPDH空白組組別 E-Cad/GAPDH Vim/GAPDH α b

2.5 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞 E-Cad、Vim 和 α-SMA 蛋白表達量的影響

與空白組比較,模型組E-Cad 蛋白表達量顯著性降低(P<0.01),Vim 和α-SMA 蛋白表達量顯著性增加(P<0.01)。 與模型組比較,丹酚酸B 組和配伍組E-Cad 的表達量顯著性增加(P<0.01),Vim的表達量顯著性降低(P<0.01),且配伍組α-SMA表達量顯著性降低(P<0.01),見圖1 和表7。

圖1 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA 表達的影響

表7 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA 蛋白表達的影響(,n=3)

表7 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞 E-Cad、Vim 及 α-SMA 蛋白表達的影響(,n=3)

注: 與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01。

0.68±0.02 0.62±0.08 0.41±0.02模型組 0.21±0.02a 1.18±0.03a 1.19±0.02a黃芪多糖組 0.19±0.02 1.23±0.04 0.83±0.06b丹酚酸 B 組 0.38±0.14b 0.88±0.02b 0.91±0.05配伍組 0.57±0.04b 0.67±0.03b 0.40±0.03空白組b-SMA/GAPDH組別 E-Cad/GAPDH Vim/GAPDH α

2.6 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞FN 和Col-I 表達量的影響

與空白組比,模型組FN 和Col-I 的表達量明顯增加(P<0.05);與模型組比較,配伍組細胞FN 和Col-I 的表達量明顯降低(P<0.05)。 同時,配伍組FN 和Col-I 的表達量低于黃芪多糖組(P<0.05)。見表8。

表8 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞FN 和Col-I 表達的影響(,n=3)

表8 黃芪多糖、丹酚酸B 及配伍對TGF-β1 誘導的A549 細胞FN 和Col-I 表達的影響(,n=3)

注: 與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,b P<0.05;與黃芪多糖組比較,cP<0.05。

組別 FN(pg/mL) Col-I(pg/mL)0.04±0.00 0.21±0.01模型組 0.09±0.00a 0.33±0.01a黃芪多糖組 0.11±0.00b 0.37±0.01丹酚酸 B 組 0.05±0.00b 0.24±0.01b配伍組 0.05±0.00bc 0.28±0.01空白組bc

3 討論

在現代醫學概念中,肺纖維化為一種慢性、進行性、病因尚未明確的致死性肺部疾病。 中醫學將肺纖維化多歸屬于“肺痹”與“肺痿”等病證范疇,主要病機為氣滯血瘀。 眾多醫家均認為,益氣與活血需貫穿整個治療過程,同時在治療肺纖維化的高頻藥物分析中也顯示,黃芪與丹參已經成為中醫臨床治療肺纖維化的首選藥對[8-10]。 黃芪味甘,性微溫,歸肺、脾經,具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、托毒排膿等功效。 其中黃芪多糖抗氧化能力顯著,其能明顯減少自由基,抑制脂質過氧化物反應,減弱氣道重塑及肺泡損傷發生的可能性[11],并能通過調控與肺纖維化凋亡相關通路例如Bax 及Bcl-2 信號途徑蛋白表達量和抑制非Smad/TGF-β1 信號通路來干預肺纖維化的發生[12-13]。 丹參因具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩和涼血消癰的作用,被《神農本草經》列為上品[14]。 相關研究顯示,丹參有效成分都可以延緩大鼠肺泡炎與肺纖維化的進程,并能下調大鼠肺組織TGF-β1 的蛋白表達水平與羥脯氨酸的含量,同時還可進一步通過調控Smad/TGF-β1 信號轉導通路,影響機體氧化/抗氧化的平衡,起到防治肺纖維化的作用[15-20]。 與此同時,本課題組前期研究發現,與黃芪和丹參的有效成分單用組相比,黃芪多糖與丹酚酸B 配伍組對博來霉素所致大鼠肺纖維化模型的改善效果更優,且在細胞水平進行的丹酚酸A、丹參酮ⅡA 和丹參素進行比較研究中,也發現丹酚酸B 通過調節TGF-β1 誘導的A549細胞的存活率、FN、Col-I 和E-Cad 等代表性指標,產生抑制EMT 的作用[6]。 因此本實驗基于前期基礎上選擇黃芪多糖配伍丹酚酸B,從益氣活血角度進行體外實驗。

肺纖維化是一個復雜的病理過程,特征主要為肺上皮細胞嚴重損傷,(肌)成纖維化細胞增殖和異常的膠原沉積所導致的損傷過度修復。 其中,肺上皮細胞的損傷和功能障礙是啟動肺纖維化的核心。當肺上皮細胞持續損傷時,精疲力竭的Ⅱ型肺泡上皮細胞無法向Ⅰ型肺泡上皮細胞轉化,有可能引起EMT 的上游信號通路的激活,進而導致(肌)成纖維細胞的積累以及細胞外基質的沉積,產生纖維化灶[21]。 同時,ECM 作為由分泌蛋白相互連接而形成的動態支架,始終在進行重塑,以此來維持組織損傷修復與穩態[22]。 α-SMA 作為平滑肌細胞收縮結構的基礎,主要分布于血管平滑肌與肌上皮細胞中,其可反映平滑肌的數量與收縮能力。 Vim 則為一種重要的細胞骨架蛋白,在發生肺纖維化時表達量增加[23]。 上皮細胞特異性表型的跨膜粘附受體E-Cad 可作為EMT 過程中上皮細胞的標志物。 在肺纖維化過程中,纖維化程度越高,E-Cad 表達量越低[24]。 FN 為一種二聚糖蛋白,是成纖維細胞主要的趨化因子與活化因子,當FN 表達量增加時,會引發趨化細胞遷移,并使纖維化細胞發生聚集[25]。 膠原作為ECM 的重要成分之一,當EMT 發生時,膠原合成和降解的平衡遭到破壞,COL-I 表達增加導致ECM 沉積,因此COL-I 對維持肺的擴張性程度起著決定性的作用[26]。 在氧化應激、炎性因子和細胞因子尤其是TGF-β1 的刺激下,肺泡上皮細胞逐漸失去緊密連接以及上皮E-Cad,獲得α-SMA 和Vim 等(肌)成纖維細胞特異性蛋白,并沿著新分泌的ECM的代表性組成成分 FN 與 COL-I 遷移。 因此,α-SMA、Vim、E-Cad、FN、COL-I 的表達異常是畸形激活EMT 的關鍵指標[27]。

本研究結果顯示,實驗藥物能下調α-SMA、Vim基因與蛋白的表達,上調E-Cad 的表達,且黃芪多糖與丹酚酸B 配伍組效果優于單用組。 同時,黃芪多糖與丹酚酸B 配伍后可抑制ECM 成分FN、COL-I的表達,結果表明黃芪—丹參組分配伍能一定程度抑制TGF-β1 的刺激下肺泡上皮細胞的EMT 進程,從而削弱肺纖維化程度,這些作用機制的揭示為指導臨床用藥提供了可靠的藥理學依據,但其作用與機制仍有待進一步深入探討。