血栓通注射液對氧化應激及低氧條件下神經元的抑制作用及機理研究

任文娟 趙曉燕

三七主要用于活血化瘀、消腫止痛等,近來發現其主要藥效成分三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)用于心腦血管疾病的治療。 血栓通是中藥三七的提取物,其主要成分為三七總皂苷,三七總皂苷中含多種單體皂苷成份。 血栓通注射液具有改善腦供血,增加腦灌注,抑制血小板聚集,降低血黏度等多種作用。 目前,血栓通注射液治療腦卒中意見不統一。 有學者認為,血栓通注射液有助于腦卒中的恢復,如Meng LP 等[1]發現PNS 可通過miR-155 調控炎癥因子的表達,減輕SH-SY5Y 細胞缺血再灌注損傷。 但還有一些學者對血栓通注射液的細胞保護作用持有相反意見,比如聶亞雄等[2]發現血栓通注射液治療超早期大量腦出血時,可加劇早期腦水腫,引起大鼠神經功能缺損計分增加。 在哺乳動物中,存在三個高度保守的Hedgehog同源基因:SonicHedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh),它們分別編碼Shh、Ihh 和Dhh 蛋白。 Shh 蛋白是一種細胞外的配體,Shh 通路上的啟動蛋白。 細胞處于靜止狀態時,Shh蛋白與7 次跨膜受體Smo 蛋白結合,抑制Smo 活性,從而抑制其下游的反應。 當Shh 激活時,Shh 結合到12 次跨膜受體Ptch 蛋白上,解除Ptch 對 Smo的抑制作用,從而激活下游的Gli 家族蛋白,調節細胞周期進程、對抗凋亡、神經發生、細胞增殖和自我更新,參與損傷組織修復[3-4]。 近年來,Shh 通路在神經系統研究也頗多,如Jin 等[5]人發現Shh 激動劑激活Shh 通路可改善局灶性皮質缺血性損傷導致的行為缺陷。

本實驗運用神經母細胞瘤細胞(SY5Y)及小鼠大腦皮層神經元,進行AAPH 氧化應激損傷,并將神經元進行氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)處理,模擬體外腦卒中,觀察神經元氧化應激損傷及缺血缺氧的作用及對Hedgohog-Patched-Smoothened 信號通路的影響,探究血栓通注射液對腦卒中神經元的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

美國癌癥研究所(institute of cancer research,ICR)SPF 級孕15 ~17 天小鼠,購自北京維通利華實驗動物有限公司[許可證編號:SCXK(京)2012-0001]。 SC8 細胞、cyclopamine 為陳偉導師饋贈;感受態細胞為北京天壇醫院李昊文老師饋贈。

1.2 實驗藥物與試劑

血栓通注射液為北京天壇醫院杜萬良老師饋贈,產自廣西梧州制藥公司。 TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司;胰蛋白酶、DMEM 培養基、MEM 培養基、馬血清(horse serum,HS)、胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)購自美國 Gibco 公司;臺盼藍、DNA 酶I 購自美國Sigma 公司;CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學研究所,SAG 購自Santa Cruz Biotechnology。

1.3 細胞培養

1.3.1 孕15 ~17 天小鼠胎鼠皮層神經元細胞原代培養 培養板的預處理:25 cm 細胞培養瓶或96孔細胞培養板,加入0.1g/L 多聚-L-賴氨酸包被2小時。 以三蒸水沖洗干燥后待用;孕15 ~17 天ICR 小鼠,常規麻醉消毒,剪開腹部皮膚及腹膜,取出胎鼠,放入預冷的DMEM 基礎培養基中;將其放置于解剖顯微鏡下緩慢剝離胎鼠的頭部皮膚與顱骨,暴露兩側大腦半球,用解剖鑷小心分離并取出雙側皮層,輕輕剔除血管和腦膜組織,置于含預冷DMEM 基礎培養基的6 cm 的培養皿中;將上述組織塊移入至15 mL 離心管中,用1 mL 槍輕輕吹打使皮層成碎片,1500 r/分鐘,離心5 分鐘;去上清,加5 mL 0.25%胰蛋白酶和100 μL DNA 酶 I,在37℃水浴箱中作用15 ~20 分鐘,其間振蕩2 ~3次,當消化液混濁、不含有組織塊時,加含10%FBS和10%HS 的DMEM/F12 培養基終止;將細胞懸液用70 目細胞篩過濾后,1500 r/分鐘,離心5 分鐘;棄上清,沉淀物中加入神經元接種培養基,臺盼藍染色,細胞計數板計數,以1×105/mL 的密度將細胞種植于培養板中,然后置于37℃、5% 的CO2培養箱中培養;4 小時細胞貼壁后,換神經元維持培養基,以后每周2 ~3次半量換液。

1.3.2 SY5Y 細胞培養 SY5Y 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養基中,在37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養,每隔2 ~3 天傳代1 次。

1.3.3 SC8 細胞培養 SC8 細胞是U2OS 細胞穩定轉染的βarr2-GFP 和 Smothened-633(Smo-633)的細胞系。 SC8 細胞置于含10%胎牛血清和抗生素(含100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 鏈霉素)的 MEM 培養基中,在37℃、5% CO2 的恒溫培養箱中培養,每隔2 ~3 天傳代1 次。

1.4 CCK-8 檢測原代神經元細胞和SY5Y 細胞存活率

1.4.1 原代神經元細胞存活率 原代神經元細胞以1×105/mL 的密度接種于96 孔板,每孔100 μL,培養7 天進行實驗,顯微鏡下觀察神經元之間形成神經網絡。 實驗分為對照組、AAPH 組和AAPH+血栓通注射液組。 AAPH 組AAPH 濃度為20 mmol/L;AAPH+血栓通注射液組AAPH 濃度為20 mmol/L,血栓通注射液濃度分別為 0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL;對照組加同等體積的正常培養基,每組3 個復孔。 置入 37℃、5%CO2培養箱培養4 小時后,每孔加10 μL CCK-8 試劑,在 37℃孵育4 小時,用酶標儀在450 nm 波長處檢測每孔的光密度,3 個復孔取平均值,計算細胞存活率。 實驗重復3 次。 細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%[注:As:實驗孔(含有細胞的培養基、CCK-8);Ac:對照孔(含有細胞的培養基、CCK-8);Ab:空白孔(不含細胞和CCK-8)]。 實驗分為對照組、OGD 組和血栓通注射液組,對照組神經元培養基換成含糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2孵箱中常氧培養,OGD 組神經元培養基換成無糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養。 血栓通注射液組,培養基換成含 0.25、0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液的無糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養。 培養20 小時后,CCK-8 檢測原代神經元存活率,檢測方法同上。

1.4.2 SY5Y 細胞存活率 收集對數期生長的SY5Y 細胞接種于 96 孔板,100 μL/孔(約 2×105/mL),置 37℃,5% CO2細胞培養箱培養過夜。 將SY5Y 細胞分為對照組、AAPH 組和AAPH+血栓通注射液組。 AAPH 組 AAPH 濃度為 20 mmol/L。AAPH+血栓通注射液組AAPH 濃度為20 mmol/L,血栓通注射液濃度分別為0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、 1、2 mg/mL。 對照組加同等體積的正常培養基,每組3 個復孔。 置入37℃、5%CO2培養箱培養6 小時后,CCK-8 檢測SY5Y 細胞存活率,檢測方法同原代神經元的檢測。

1.5 實時定量RT-PCR 的方法檢測Gli1 的表達

原代神經元細胞以1×105/mL 的密度接種于6孔板上,每孔2 mL,培養至第7 天進行實驗。 實驗分為對照組、SAG 組、cyclopamine 組、血栓通注射液組、SAG+cyclopamine 組和SAG+血栓通注射液組。對照組神經元培養基換成無糖Earle's 緩沖液,于37℃ 、5%CO2低氧孵箱中 1% O2培養。 SAG 組,培養基換成含 0.05、0.1、0.25 μmmol/L SAG 的無糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養。 cyclopamine 組,培養基換成含 2 μmmol/L cyclopamine 的無糖 Earle's 緩沖液,于 37℃、5%CO2低氧孵箱中1% O2培養。 血栓通注射液組,培養基換成含 0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液的無糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養。 SAG+cyclopamine 組,換成同時含 0.05、0.1 μmmol/LSAG 和含 2 μmmol/L cyclopamine 的無糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養。 SAG+血栓通注射液組,換成同時含0.05、0.1 μmmol/L SAG 和含 2 mg/mL 血栓通注射液的無糖Earle's 緩沖液,于 37℃、5% CO2低氧孵箱中1%O2培養。 Trizol 法提取 RNA,用實時定量 PCR 儀檢測神經元中Gli1 的表達。

1.6 共聚焦顯微鏡觀察SC8 細胞中βarr2-GFP 的分布情況

將 SC8 細胞分為 4 組:對照組、SAG 組、cyclopamine組和血栓通注射液組。 對照組將培養基換成無糖Earle's 緩沖液,于 37℃、5%CO2低氧孵箱中 1%O2培養。 SAG 組,培養基換成含 0.25 μmmol/L SAG 的無糖 Earle's 緩沖液,于 37℃ 、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養。 cyclopamine 組,培養基換成含2 μmmol/L cyclopamine 的無糖 Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中 1%O2培養。 血栓通注射液組,培養基換成含2 mg/mL 血栓通注射液的無糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養。 20 小時后,隨機選取多個視野,激光共聚焦顯微鏡觀察SC8 細胞中βarr2-GFP 的分布情況。

1.7 統計學處理

所有數據采用SPSS17.0 軟件進行分析處理。本研究計量資料經檢驗均符合正態分布且方差齊,以均數±標準差()表示,數據采用t檢驗,組間比較用配對t檢驗,P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血栓通注射液對AAPH 造成SY5Y 細胞損傷的影響

AAPH 作為一個氧自由基誘發劑,可誘導氧化應激反應。 當20 mmol/L AAPH 作用SY5Y 細胞6小時后,與對照組相比,SY5Y 細胞存活率下降,差異有統計學意義(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重了AAPH 造成的SY5Y 細胞的損傷,其中血栓通注射液濃度為 0.015625、0.03125、0.0625、0.125 mg/mL 時,細胞存活率與AAPH 組比較無統計學意義(P>0.05)。 當血栓通注射液濃度為0.25、0.5、1、2 mg/mL 時,細胞存活率下降,與 AAPH 組比較有統計學差異(P<0.01)。 見表1。

表1 不同濃度血栓通注射液對AAPH 造成SY5Y 細胞損傷的影響()

表1 不同濃度血栓通注射液對AAPH 造成SY5Y 細胞損傷的影響()

注: 與對照組比較,aP<0.01;與AAPH 組比較,bP<0.01。

組別 n 細胞存活率(%)3 1.00±0.03 AAPH 組 3 0.52±0.04a AAPH+血栓通注射液(0.015625 mg/mL)組 3 0.50±0.07 AAPH+血栓通注射液(0.03125 mg/mL)組 3 0.46±0.05 AAPH+血栓通注射液(0.0625 mg/mL)組 3 0.48±0.04 AAPH+血栓通注射液(0.125 mg/mL)組 3 0.43±0.08 AAPH+血栓通注射液(0.25 mg/mL)組 3 0.32±0.03b AAPH+血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.29±0.03b AAPH+血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.22±0.06b AAPH+血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.14±0.02對照組b

2.2 血栓通注射液對AAPH 造成神經元損傷的影響

當20 mmol/L AAPH 作用神經元4 小時后,與正常對照組相比,神經元存活率下降,差異有統計學意義(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重AAPH 造成神經元損傷,其中血栓通注射液濃度為0.125、0.25、0.5 mg/mL 時,神經元存活率與 AAPH組比較無統計學意義(P>0.05)。 當血栓通注射液濃度為1、2 mg/mL 時,神經元存活率下降至(0.29±0.06)、(0.16±0.06),與 AAPH 組比較有統計學差異(P<0.01)。 見表 2。

表2 不同濃度血栓通注射液對AAPH造成神經元損傷的影響()

表2 不同濃度血栓通注射液對AAPH造成神經元損傷的影響()

注: 與對照組比較,aP<0.01;與AAPH 組比較,bP<0.05,cP<0.01。

組別 n 細胞存活率(%)3 1.00±0.02 AAPH 組 3 0.40±0.07a AAPH+血栓通注射液(0.125 mg/mL)組 3 0.43±0.08 AAPH+血栓通注射液(0.25 mg/mL)組 3 0.45±0.05 AAPH+血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.41±0.04 AAPH+血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.29±0.06b AAPH+血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.16±0.06對照組c

2.3 血栓通注射液對低氧條件下神經元的存活率的影響

神經元的存活率降至(0.76±0.03), 較對照組明顯下降(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重了神經元的損傷,當血栓通注射液濃度為0.5、1、2 mg/mL時,神經元的存活率分別為(0.67±0.02)、(0.57±0.03)、(0.53±0.04),與 OGD 組相比均有統計學差異(P<0.01)。 PSN 可加重低氧條件下神經元的損傷,且呈劑量依賴性,隨著血栓通注射液濃度的增加,神經元的存活率降低更加明顯。 見表3。

表3 不同濃度下血栓通注射液對低氧條件下神經元存活率的影響()

表3 不同濃度下血栓通注射液對低氧條件下神經元存活率的影響()

注: 與對照組比較,aP<0.01;與OGD 組比較,bP<0.01。

組別 n 細胞存活率(%)3 1.00±0.02 OGD 組 3 0.76±0.03a OGD+血栓通注射液(0.25 mg/mL)組 3 0.72±0.03 OGD+血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.67±0.02b OGD+血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.57±0.03b OGD+血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.53±0.04對照組b

2.4 血栓通注射液對低氧條件下神經元Gli1 表達的影響

在低氧環境中,0.25 μmmol/L SAG 可使 Gli1表達明顯升高(P<0.01),與對照組比較增加(3.56±0.65 ) 倍。 Hedgehog 通 路 的 抑 制 劑cyclopamine可使Gli1 表達量下降,當cyclopamine 濃度為 2 μmmol/L 時,Gli1 表達量下降至(0.14±0.03)倍。 同樣發現 0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液也可抑制 Gli1 的表達,Gli1 表達量分別下降至(0.30±0.08)、(0.16±0.04)、(0.15±0.03)倍,與cyclopamine 作用一致。 見表 4。

表4 不同濃度血栓通注射液對低氧條件下神經元Gli1 的表達的影響()

表4 不同濃度血栓通注射液對低氧條件下神經元Gli1 的表達的影響()

注: 與對照組比較,aP<0.01。

3 1.00±0.04 SAG 組 3 3.56±0.65a Cyclopamine 組 3 0.14±0.03a血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.30±0.08a血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.16±0.04a血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.15±0.03水平對照組組別 n Gli1 a

2.5 血栓通注射液對低氧條件下SAG 導致的Gli1表達升高的影響

0.05 和 0.1 μmmol/L SAG 均可增加 Gli1 的表達,分別為(3.09±0.31)倍和(5.75±0.68)倍(P均<0.01),0.1 μmmol/L SAG 組 Gli1 增加更明顯。 2 mg/mL 血 栓 通 注 射 液 和 2 μ mmol/L cyclopamine 均可降低Gli1 的表達,分別降至(0.19±0.06)倍和(0.08±0.01)倍(P均<0.01),結果與前面實驗結果一致。 然而,當SAG 和血栓通注射液或cyclopamine 同時作用神經元時,發現血栓通注射液可抑制SAG 誘導的的Gli1 表達增加,血栓通注射液使0.1 μmmol/L SAG 組 Gli1 增加(5.75±0.68)倍降至增加(2.56±0.35)倍,使 0.05 μmmol/L SAG 組Gli1 增加(3.09±0.31)倍降至增加(1.7±0.21)倍(P均<0.01),作用與 cyclopamine 相似。 見表 5。

表5 血栓通注射液對低氧條件下SAG 導致的Gli1 表達升高的影響()

表5 血栓通注射液對低氧條件下SAG 導致的Gli1 表達升高的影響()

注: 與對照組比較,a P<0.01;與 SAG(0.1 μmmol/L)組比較,bP<0.01;與 SAG(0.05 μmmol/L)組比較,cP<0.01。

3 1.00±0.04 Cyclopamine 組 3 0.08±0.01a血栓通注射液組 3 0.19±0.06a SAG(0.1 μmmol/L)組 3 5.75±0.68a SAG(0.1 μmmol/L)組+Cyclopamine 組 3 2.23±0.38b SAG(0.1 μmmol/L)組+血栓通注射液組 3 2.56±0.35b SAG(0.05 μmmol/L)組 3 3.09±0.31a SAG(0.05 μmmol/L)組+Cyclopamine 組 3 1.95±0.23c SAG(0.05 μmmol/L)組+血栓通注射液組 3 1.71±0.21水平對照組組別 n Gli1 c

2.6 血栓通注射液對Smothened 的影響

根據激光共聚焦顯微鏡觀察SC8 細胞中βarr2-GFP 的分布情況,判斷血栓通注射液對Smothened(Smo)的作用。 對照組βarr2-GFP 呈點狀聚集分布在細胞質(圖 1A)。 當 2 μmmol/L cyclopamine 作用SC8 細胞時,βarr2-GFP 的分布發生變化,在細胞質呈現均勻分布(圖1B)。 2 mg/mL 血栓通注射液處理SC8 細胞,βarr2-GFP 仍呈點狀聚集分布在細胞質(圖1C)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察SC8細胞中βarr2-GFP 的分布情況

3 討論

腦卒中是由腦血管病變引起的腦部疾病的總稱,故又稱為“腦血管病”。 腦缺血再灌注損傷是腦卒中很重要的病理生理過程,再灌注損傷主要是通過引起自由基過度產生及其“瀑布式”連鎖反應等一系列氧化應激變化,導致細胞內大分子如核酸、脂質、蛋白質等的氧化損傷,從而引起神經細胞死亡[6-7]。

AAPH 作為一個氧自由基引發劑,可以誘導細胞內氧化損傷,產生各種病理變化,在氧化應激疾病模型中廣泛應用[8-9]。 目前研究腦卒中的方法主要有體內大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)和體外 OGD[10-11]。 如 MO ZT[11]以PC12 細胞OGD 為模型,模擬腦卒中,并探索石菖蒲提取物β-細辛腦對細胞自噬的作用等。 本研究以AAPH 作用造成氧化應激損傷及OGD 處理模擬體外缺血性腦卒中狀態。 AAPH 可造成SY5Y 細胞及神經元損傷;神經元經OGD 處理20 小時后,神經元的存活率較正常對照組明顯下降(P<0.01)。 這與缺血性腦卒中后神經細胞受損結果一致。

課題組還發現,血栓通注射液可加重AAPH造成的SY5Y 細胞及神經元細胞損傷;且血栓通注射液降低低氧條件下神經元的存活率,當血栓通注射液 濃度為 0.5、1、 2 mg/mL 時,與 OGD 組相比各組均(P<0.01),且呈劑量依賴性。 血栓通注射液是中藥血栓通的主要成分,血栓通的主要成分為血栓通注射液,包含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷 R1 等。 在 MCAO 造成的大鼠腦梗死模型中,血栓通注射液能明顯改善腦功能,改善腦血管滲漏,減少腦組織內炎性細胞浸潤,對大鼠腦微血管內皮細胞進行OGD 處理,發現血栓通注射液可降低TNF-α、IL-8 及RIG-I 受體通路調控的下游細胞因子水平,血栓通注射液可能是通過RIG-I 信號通路發揮腦缺血時抗炎作用[12]。 HU SN 等[13]發現三七皂苷可通過激活PI3K/Akt/Nrf2通路,從而保護腦微血管內皮細胞因缺血再灌注誘導的血腦屏障破壞。 但是,部分學者對血栓通注射液的細胞保護作用持有相反意見。 在探索血栓通注射液對腦出血大鼠腦水腫超早期影響的研究[2]中發現,較腦出血模型組,血栓通注射液可加重大鼠神經缺損癥狀,增加腦含水量及鈉離子含量,說明血栓通注射液治療超早期腦出血,可加劇腦水腫,加重大鼠神經功能缺損癥狀。 LI SY等[14]研究發現,人參皂苷Rd 本身對BASMCs 細胞無毒性作用,但可加重H2O2造成BASMCs 細胞存活率的下降,并且呈現濃度依賴性。 H2O2作用BASMCs 細胞后,早期凋亡率為(20.9±3.8)%,10 μmmol/L人參皂苷 Rd 預處理 30 分鐘,細胞凋亡率下降到(31.5±3.6)%,人參皂苷可加重H2O2造成的促凋亡蛋白Bax 的增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的降低和Bcl-2/Bax 比率的降低,增加細胞色素C的釋放和caspase-9/caspase-3 激活,并降低線粒體膜電位的穩定性。

近年來,Shh 通路在缺血性腦病的研究中越來越多。 Shh 通路通過上調緊密連接(TJ)蛋白促進血腦屏障完整性,對卒中后血腦屏障破壞產生保護作用[15]。 ZHANG J 等[16]發現 SD 大鼠經過 MCAO后,立即給予側腦室注射 Shh 通路抑制劑cyclopamine,24 小時后與對照組比較,cyclopamine組Gli1、Ptch1 與SOD1 表達下降,梗死面積增加,腦水腫明顯,神經行為缺損加重。 這些數據表明,抑制Shh 通路后,加重腦卒中的神經損傷。 在本實驗中,發現血栓通注射液可以抑制神經元OGD 后Gli1 的表達。 SAG 是 Shh 通路 Smo 的激活劑,可使 Gli1 表達升高,cyclopamine 是Smo 的抑制劑,可使Gli1 表達下降,因此選用SAG 和cyclopamine 作為本實驗的陽性對照藥物。 神經元經過OGD 處理后,0.25 μmmol/L SAG 可使 Gli1 表達明顯升高(P<0.01),2 μmmol/L cyclopamine 可使 Gli1 表達量下降,0.5、1、2 mg/mL血栓通注射液也可抑制Gli1 的表達,與cyclopamine作用一致。 并且,經過進一步研究,課題組發現血栓通注射液可抑制 SAG 導致的 Gli1 的升高。 當SAG 和血栓通注射液或cyclopamine同時作用神經元時,發現血栓通注射液可抑制SAG 誘導的的Gli1 表達增加,作用與cyclopamine 相似。

Smo 受體激動劑具有保護神經和促進缺血性腦損傷后再生的作用[17]。 Smo 激活后對G 蛋白偶聯受體(G protein coupled receptor,GPCR)信號通路有重要作用,它可以磷酸化GPCR,招募βarr2 蛋白聚集,發揮內吞作用[18]。 在正常情況下,βarr2 均勻分布于細胞質中,當 Smo 或者 Smo-633 過表達時,βarr2 在細胞質中發生點狀聚集,經過cyclopamine處理后,βarr2 又重新均勻分布于細胞質中[18]。 課題組發現,SC8 細胞中由于Smo-633 過表達,βarr2-GFP 呈點狀聚集分布在細胞質,給予cyclopamine 處理,發現βarr2-GFP 均勻分布于細胞質中,與之前研究相似。 為了驗證血栓通注射液是否通過Smo 抑制Gli1 的降低,故用血栓通注射液作用SC8 細胞,發現血栓通注射液組,βarr2-GFP 呈點狀聚集分布在細胞質,說明血栓通注射液不能抑制Smo,可能抑制Smo 下游信號分子。

綜上所述,血栓通注射液加重體外低氧后神經元的損傷,可能通過抑制Hedgehog 通路發揮作用,血栓通注射液抑制低氧條件SAG 導致的Gli1 表達升高,而不影響Smo,說明其可能通過抑制Smo 下游因子來抑制Gli 的表達。 因此,中藥血栓通注射液應用于腦血管病的治療時要“辨證論治”,依據中醫理論和中藥藥理學辨證選藥,科學、規范、系統地治療腦血管病。 本實驗亦有不足之處,體外低氧狀態模擬腦卒中有一定的局限性,需進一步的驗證。