火針調控白細胞介素23/輔助性T 細胞17軸干預銀屑病炎性機制的研究

王群 王鑫 劉璐 魏江艷 孫敬青

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病,皮損局部以紅斑鱗屑為主要表現,病情反復,纏綿難愈,往往給患者造成較大的經濟負擔和心理負擔。 研究表明,2017 年全球銀屑病總患病率介于0.09% ~5.10%之間,國內患病例數約866.5 萬,國內外銀屑病患病率均有逐年上升的趨勢[1-3]。 目前國內主要以維A 酸類、維生素D3 衍生物、糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物治療為主,但存在療效不穩定、不良反應多、停藥易復發等問題。 銀屑病發病與遺傳、環境及免疫失調等多種因素相關,其中白細胞介素(interleukin,IL)-23/輔助性T 細胞17(T helper cell 17,Th17)炎癥軸具有關鍵作用[4],IL-23 和IL-17 作為重要促炎細胞因子[5]介導炎癥放大和皮損惡化;IL-10 作為抗炎細胞因子,可能具有阻斷IL-23/Th17軸的作用。 火針是將金屬針燒至通紅,迅速點刺穴位、皮膚的針法,具有抗炎消腫、調節免疫及激發自身機體良性調節機制的作用[6]。 研究表明,火針能夠有效治療銀屑病,但目前有關火針治療銀屑病作用機制的研究較少[7]。 本實驗通過咪喹莫特誘導小鼠構建銀屑病模型,觀察小鼠血清IL-23、IL-17 和IL-10 表達水平的變化,探究火針干預銀屑病樣皮損病變過程中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康 BALB/c 小鼠18 只,雄性,8 周齡,體質量(20±1.0)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。 飼養溫度20 ~25℃,相對濕度60%,予12 小時晝夜循環光照,可以自由獲得食物及飲水,適應性飼養3 天。 本研究經首都醫科大學動物實驗機構倫理審查委員會批準(批準號:20201113)。

1.2 火針及藥物

毫火針,蘇州市華倫醫療用品有限公司,批號:210701;白凡士林,國藥集團化學試劑有限公司,批號:20171206;咪喹莫特乳膏,四川明欣藥業有限責任公司,批號:39210804。

1.3 實驗試劑及儀器

蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液(珠海貝索生物技術有限公司,批號:C200701),IL-10、 IL-23、 IL-17 ELISA 試 劑 盒 ( Phoenix Pharmaceuticals, Inc), Multiskan MK3 酶標儀(Thermo Fisher Scientific 公司),低溫高速離心機(美國Beckman 公司),ASP6025 全封閉組織脫水機、EG1150 H+C 包埋機、RM2245 半自動輪轉式切片機、APERIO CS2 顯微鏡(德國 Leica 公司)。

1.4 分組及造模

采用隨機數字表法將18 只小鼠隨機分為三組,對照組、模型組和火針組,每組6 只。 模型組和火針組采用咪喹莫特誘導法制備銀屑病小鼠模型:小鼠背部2 cm×2 cm 皮膚區域剃毛,涂擦5%咪喹莫特乳膏,劑量 62.5 mg/只,1 次/天,連續 9 天[8]。 對照組同樣方法涂抹等量凡士林。

1.5 干預方法

正常組:不作處理,第4 ~9 天每日抓取、固定。模型組:第4 ~9 天每日造模后抓取、固定。 火針組:第4 ~9 天每日造模后行火針點刺治療:酒精燈外焰將火針燒至紅白,迅速點刺雙側內關(約刺入0.5 mm)、雙側足三里(約刺入1.0 mm)。 取穴參照《實驗針灸學》[9]。

1.6 取材

實驗第10 天小鼠下腹腔注射1% 戊巴比妥(0.1 mL/10 g),深度麻醉后眼球取血、分離血清,置于-80℃冰箱保存備用;每組采用隨機數字表法選取兩只小鼠剪取背部病變皮膚組織,置于4%多聚甲醛溶液中固定,待用。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 小鼠皮損組織病理學 4%多聚甲醛溶液中待用皮膚組織固定72 小時后,脫水、包埋、切片(5 μm)、HE 染色、封片,顯微鏡下觀察病理變化。

1.7.2 酶聯免疫吸附法檢查小鼠血清IL-10、IL-17和IL-23 表達水平 各試劑平衡至室溫,加樣品和標準品,37℃孵育90 分鐘,棄液、洗版,每孔加入相應抗體工作液,37℃孵育90 分鐘,棄液,洗板4 次,每孔加100 μL Streptavidin-HRP 工作液,37℃避光孵育30 分鐘,棄液,洗板 4 次,每孔加 100 μL 底物顯色工作液,37℃避光孵育30 分鐘,每孔加100 μL終止液,終止反應后立即用酶標儀在波長450 nm 處測量各孔吸光度,計算相應濃度。

1.8 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件分析結果數據,計量數據以均數±標準差()表示。 數據呈正態分布、方差齊時采用單因素方差分析,兩組間比較用LSD檢驗;數據非正態分布或方差不齊時采用非參數檢驗,以P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠皮損變化

對照組小鼠背部皮膚光滑,部分可見薄層毛發長出;模型組小鼠皮損處皮膚干燥,可見紅斑、出血點、明顯鱗屑附著及皮損邊緣類束狀發樣改變;對照組較模型組紅斑、鱗屑及浸潤程度有所減輕。 見圖1。

圖1 各組小鼠皮損情況變化比較

2.2 各組小鼠皮損病理變化

對照組小鼠皮膚病理可見表皮層極薄,真皮層無毛細血管擴張增生,無炎性細胞浸潤;模型組可見表皮角化不全、角化過度,棘層明顯增厚,表皮突水腫增粗,真皮層毛細血管擴張增生,真皮淺層炎性細胞浸潤;相較于模型組,火針組棘層肥厚明顯減輕。 見圖 2。

圖2 各組小鼠皮損病理情況比較

2.3 各組小鼠血清IL-10、IL-17 和IL-23 表達水平變化

與對照組相比,模型組小鼠血清IL-10 表達水平顯著下降,IL-23 和IL-17 表達水平顯著上升,具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,火針組小鼠血清IL-10 表達水平顯著上升,IL-23 和IL-17 表達水平顯著下降,具有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠血清IL-10、IL-17、IL-23 表達水平比較(,pg/mL)

表1 各組小鼠血清IL-10、IL-17、IL-23 表達水平比較(,pg/mL)

注: 與對照組相比,aP<0.05,bP<0.01;與模型組相比,cP<0.05。

IL-10 IL-17 IL-23對照組組別 鼠只6 164.37±24.40 40.34±6.72 5.88±0.77模型組 6 142.45±12.31a 51.20±7.45a 7.50±1.08b火針組 6 166.25±13.92c 41.10±7.38c 6.51±0.41c

3 討論

銀屑病是一種免疫介導的炎性皮膚病,其發生發展與免疫失調密切相關。 IL-23/Th17 軸被確定為銀屑病發病機制中的主要免疫通路[5]。 IL-23 主要由活化的抗原提呈細胞(APCs)產生,如樹突狀細胞和單核/巨噬細胞[10],對維持Th17 細胞高水平分泌以IL-17 為主的炎性細胞因子至關重要[11-13]。 有研究表明,IL-10 能夠抑制APCs 及抗原呈遞過程[14-15]和直接抑制Th17 細胞的促炎作用[14,16], 很可能對IL-23/Th17 軸具有阻斷作用。 研究表明,相較于正常人,尋常型銀屑病患者血清IL-23、IL-17 表達水平顯著升高的同時,IL-10 表達水平顯著下降,與本研究結果一致[17-18]。 證明在銀屑病發病過程中,IL-23/Th17炎癥軸放大的同時,IL-10 表達受抑制。本研究結果表明,火針能夠抑制銀屑病模型小鼠血清IL-23 和IL-17 的表達,同時提高IL-10 表達水平。證明火針可能通過促進 IL-10 表達,抑制 IL-23/Th17 炎癥軸從而發揮抗炎作用,以改善銀屑病樣皮損病變。

火針療法源遠流長,在《靈樞》中被稱為“焠刺”。 隨著對火針的不斷改進,毫火針具有疼痛輕、創傷小、安全性更高等優勢,現已被用于治療皮膚科諸多病種[19]。 中醫認為,火針借助火之溫熱,具有助陽益氣、舒筋通絡、祛瘀行滯、活血除濕、調節臟腑等功效。 現代研究發現火針能夠激發機體自我調節機制,加快炎性物質吸收,調節多種參與炎癥反應的細胞因子含量及免疫細胞平衡實現抗炎消腫、調節機體免疫功能的作用[6]。 文獻研究表明,火針對銀屑病的療效是肯定的[7]。 不過有醫家在應用火針治療銀屑病過程中出現皮損加重的情況,這可能與銀屑病分期、取穴、針刺密度和深度等有關。 一般認為銀屑病進行期應當盡量避免皮膚刺激,避免同形反應,此時處在病情進展期,盡管治療方式無誤,也可能出現皮損不減反增的情況。 本研究選擇遠端取穴,在第4 ~9 天進行火針治療,表明可能在銀屑病進行期,亦可以選擇火針干預,為臨床選用火針治療銀屑病提供實驗依據。

目前中醫機制方面,主流研究認為痰濕是銀屑病的主要病機之一,治療當以健脾運脾為主[20],脾虛也確實會加重銀屑病樣皮損病變[21],為健脾化濕治則提供了選穴依據。 名老中醫王樂亭先生所創“老十針”是其治療脾胃疾病的學術思想精髓[22],內關、足三里是此針灸處方中四肢所選之穴,二者善治胃腸腑病癥,具有健脾行氣、益胃止痛之效。本研究以內關、足三里為選穴,一為從脾胃論治銀屑病,二為遠端取穴,避免局部刺激。 銀屑病病機復雜,臨床的分期治療和選穴方法有待進一步研究。

本研究發現火針能夠抑制IL-23 和IL-17 表達、上調IL-10 表達水平,證明火針很可能是通過促進IL-10 表達來抑制IL-23/IL-17 炎癥軸,從而發揮抗炎作用以改善銀屑病樣皮損病變。 近些年來,生物制劑發展迅猛,與之相比火針仍然具有更廉價、更高安全性等優勢,臨床銀屑病常采用多聯療法以提高療效,其中針灸治療是中醫治療銀屑病的重要手段。 關于火針治療銀屑病更完備、更深層的作用通路,尚需進一步探究,以更好地指導火針與其他藥物聯合應用提高臨床療效。