閩楠種子對快速脫水的響應

李 娟，林建勇，歐漢彪，梁瑞龍

（廣西壯族自治區林業科學研究院 中南速生材繁育國家林業和草原局重點實驗室 廣西優良用材林資源培育重點實驗室，廣西南寧530002）

閩楠（Phoebe bournei）為樟科（Lauraceae）楠屬高大常綠喬木，為國家二級野生保護植物，也是我國特有的珍貴樹種；天然分布于浙江、福建、江西、廣東、廣西、湖南、湖北和貴州等地，垂直分布海拔范圍為100～1 000 m，均為聚集狀零星分布[1-2]。閩楠素以材質優良聞名于國內外，但由于長期對該樹種資源的不合理開發利用，其天然資源已近枯竭。閩楠結實有明顯的大小年現象，種子具有休眠特性，采收后不能直接萌發，也不耐儲藏，給閩楠苗木繁育和造林帶來諸多不便。種子是育苗造林的物質基礎。影響種子壽命的重要因素是種子含水量和貯藏溫度[3]。脫水是種子在貯藏或環境脅迫中存活、保證物種更好繁衍的適應性策略。Roberts根據低溫、脫水反映及儲藏行為，將種子分為正常性和頑拗性兩類[4]，還發現介于正常性和頑拗性之間存在第3種類型,即中間型[5]。不同類型的種子脫水敏感性不同，直接影響種子儲藏和種質資源的保存[6-11]。

吳大榮等[12]、周佑勛等[13]、李鐵華等[14]和李娟等[15]分別從種子生態學、休眠和萌發特性、種子活力及形態特征等方面對閩楠種子進行研究，但對閩楠種子的脫水耐性鮮有研究。本研究以閩楠種子為試驗材料，分析脫水對閩楠種子活力和萌發率的影響，確定閩楠種子脫水耐性及適宜貯藏的含水量，并從代謝作用、抗氧化酶系統的角度探討閩楠種子脫水敏感性機制，為解決閩楠種子的貯藏問題，保證生產用種安全及長期保存閩楠種質資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

閩楠種子采自重慶江津。2018年12月14日，采收閩楠成熟果實，將果皮去除后得到新鮮種子，立即進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子脫水處理

將新鮮種子裝入尼龍網袋，按照20∶1的體積比放入裝有變色硅膠的密閉干燥器中，硅膠變紅即更換。在第0、12、24、48、72、96、120、144和168 h分別取樣。每次取樣時，將用于測定酶活性和電導率等指標的種子樣品放入液氮速凍，置于-80℃冰箱內保存。

1.2.2 種子含水量測定

烘干前，采用電子天平（精確至0.001 g）將每個處理的種子稱重1次；隨后置于已烘干且稱過重的鋁盒中，于105℃烘至恒重，稱量種子重量。每處理10粒種子，3次重復。含水量（%）計算公式為[16]：

1.2.3 種子生活力測定

將閩楠種子剝去外種皮，采用0.4%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液浸泡，在25℃水浴鍋中水浴8～12 h，倒出TTC溶液，用蒸餾水沖洗種子3次，觀察著色情況。整個胚被染成紅色，表示有活力；胚僅有一小部分被染成紅色或完全呈白色，表示無活力。以新鮮種子為對照（CK），每處理20粒種子，3次重復。

1.2.4 種子萌發試驗

在種子解除休眠后，在直徑9 cm的培養皿內鋪墊0.5 cm厚的河沙（125℃高溫滅菌12 h），將種子均勻平鋪于其上，放入自動光照培養箱，培養條件為25℃，14 h光照/10 h黑暗。胚根突破種皮5 mm記為發芽，每日觀察、記錄萌發情況，連續3天沒有新種子萌發，結束試驗。試驗過程中適時澆水，保持沙子濕潤。每處理20粒種子，3次重復。

1.2.5 相對電導率測定

不同處理的種子各取10粒，稱重后，用清水沖洗3次，再用去離子水沖洗兩次，放入燒杯，加入30 mL蒸餾水浸沒種子，在25℃條件下浸種23 h，用電導率儀測定電導率（S1）；之后用塑料薄膜封瓶口放入沸水浴中15 min，取出后冷卻至25℃，測定其電導率（S2），以不加種子的去離子水作為空白對照，設3次重復。相對電導率（L，%）計算公式為[17]：

1.2.6 種子抗氧化酶活性測定

采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性[17]。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件處理數據和制作圖表，采用SPSS 18.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 種子含水量和生活力變化

新鮮閩楠種子的含水量為35.53%，種子失水速率呈現“快-慢-快”的趨勢（圖1）。0～24 h，含水量從35.53%降至32.17%；24～48 h，失水速率變慢；48～120 h，失水速率逐漸加快；120～144 h，失水速率最快。

圖1 閩楠種子含水量Fig.1 Moisture content of P.bournei seeds

不同含水量種子生活力和發芽率差異顯著（P＜0.05）（圖2）。隨含水量下降，種子發芽率呈先升后降的趨勢；含水量為33.72%（T2）時，種子發芽率最高（40.00%），與CK（T1）差異顯著（P＜0.05）。隨含水量下降，種子生活力呈先升后降的趨勢；含水量低于31.22%（T4）時，種子生活力與CK差異顯著（P＜0.05）。含水量降至16.09%（T9）時，種子完全失活。

圖2 閩楠種子生活力、發芽率和含水量的關系Fig.2 Relationships among seed viability,germination rate and moisture content of P.bournei

2.2 種子電導率變化

在閩楠種子脫水過程中，電導率呈現不規則波動變化（圖3）。不同含水量種子的電導率差異顯著（P＜0.05）。含水量從35.53%（T1）降至31.22%（T4）時，電導率最大（52.46%）；含水量從31.22%（T4）降至29.12%（T5）時，電導率急劇下降，此后又逐漸上升。

圖3 脫水對種子電導率的影響Fig.3 Effect of dehydration on seed conductivity

2.3 種子SOD活性變化

在脫水前期，種子SOD活性呈波動變化（圖4）。不同含水量種子SOD活性差異極顯著（P＜0.01）。含水量為33.72%（T2）和31.22%（T4）時，SOD活性極顯著高于其他含水量（P＜0.01）；含水量低于31.22%（T4）時，隨含水量下降，SOD活性呈下降趨勢。

圖4 脫水對SOD活性的影響Fig.4 Effect of dehydration on SOD activity

2.4 種子POD活性變化

POD活性在閩楠種子脫水過程中整體呈上升趨勢（圖5）。不同含水量種子POD活性差異極顯著（P＜0.01）。含水量從35.53%（T1）降至32.17%（T3），POD活性急劇增加，之后變化較平緩，其活性一直保持在較高水平。

圖5 脫水對POD活性的影響Fig.5 Effect of dehydration on POD activity

2.5 CAT活性變化

CAT活性在閩楠種子脫水過程中呈波動變化（圖6）。不同含水量種子CAT活性差異極顯著（P＜0.01）。含水量為33.72%（T2）時，CAT活性最大（145.86 nmol·min-1·g-1），極顯著高于CK（P＜0.01）；此后，CAT活性下降，到脫水中后期有較大幅度上升；含水量為19.64%（T8）時，CAT活性達到第2個峰值（179.01 nmol·min-1·g-1）；含水量降至16.09%（T9）時，CAT活性降至最低（39.02 nmol·min-1·g-1），此時種子完全失活。

圖6 脫水對CAT活性的影響Fig.6 Effect of dehydration on CAT activity

2.6 MDA含量變化

不同含水量種子MDA含量差異顯著（P＜0.05）（圖7）。含水量從35.53%（T1）降至31.22%（T4）時，MDA含量呈“降-升-降”的趨勢；含水量低于31.22%（T4）時，隨含水量下降，MDA含量不斷上升；含水量為16.09%（T9）時，MDA含量高于其他處理。

圖7 脫水對MDA含量的影響Fig.7 Effect of dehydration on MDA content

2.7 相關性分析

種子含水量與其他生理指標具有一定的相關性（表1）。種子含水量與生活力、發芽率均呈極顯著正相關（P＜0.01），表明含水量下降對種子萌發產生極大影響。SOD活性與種子生活力、發芽率均呈顯著正相關（P＜0.05）；POD活性與種子含水量、生活力均呈極顯著負相關（P＜0.01），與發芽率呈顯著負相關（P＜0.05）。

表1 閩楠種子脫水過程中各指標的相關性Tab.1 Correlations among different indexes during seed dehydration of P.bournei

3 討論與結論

3.1 討論

頑拗性種子成熟時含水量高，對脫水敏感，不耐低溫，難實現長期保存[18]。本試驗結果顯示，閩楠種子初始含水量為35.53%，種子生活力為55.00%；含水量降至29.12%時，其生活力和發芽率均降至13.33%，顯著低于初始狀態；含水量降至16.09%時，種子完全失活，種子變黑變硬。相關分析結果表明，閩楠種子含水量與種子生活力、發芽率均呈極顯著正相關，這表明其具有明顯的頑拗性特征，也證明含水量是影響閩楠種子活力的重要因素之一，是閩楠種子保存的關鍵制約因素。

研究表明，輕度脫水可促進種子發芽，提高種子萌發率。樟樹（Cinnamomum camphora）[19]、遼東櫟（Quercus wutaishanica）[20]和木奶果（Baccaurea ramiflora）[21]等樹種的種子輕度脫水后，發芽率顯著提高。本試驗中，閩楠種子具有休眠特性，新鮮種子發芽率僅為22.33%；含水量降至33.72%時，種子生活力（56.67%）與未脫水前種子生活力無顯著差異，種子發芽率（40.00%）顯著高于未脫水前，表明輕微脫水能促進閩楠種子萌發。這可能是由于輕度脫水破壞閩楠種子中抑制種子萌發的物質結構，促使種子解除休眠狀態，在生產實踐中可以適當通風干燥，促進種子萌發。

頑拗性種子脫水過程中，膜脂過氧化作用致使膜結構損傷與功能被破壞，抗氧化保護系統活性下降，自由基的積累引發細胞代謝紊亂；MDA對細胞有毒害作用，會降低抗氧化保護酶的活性[22]。在種子脫水過程中，抗氧化防御系統發揮著重要作用，其中SOD、POD和CAT能夠清除種子代謝過程中產生的自由基，保護細胞膜[22]。本試驗中，含水量從35.53%降至33.72%時，電導率上升，SOD、POD和CAT活性增加，且SOD和CAT活性達到峰值，MDA含量下降；說明抗氧化酶系統發揮作用，在一定程度上清除MDA。含水量從33.72%降至31.22%時，電導率升至最大值，SOD活性先降后升，CAT活性下降，POD活性維持在較高水平，MDA含量先升后降。說明抗氧化酶系統對細胞膜系統有一定程度的修復作用。含水量低于31.22%時，電導率先降后升，SOD活性持續降低，POD和CAT活性較高，MDA含量增加。抗氧化酶在脫水前期能保持較高活性，在一定程度上緩解細胞膜系統的損傷；隨脫水程度增加，閩楠種子膜脂過氧化程度不斷加劇，細胞膜受損愈加嚴重，含水量過低時，抗氧化酶系統不再起作用。相關分析結果表明，種子生活力和發芽率與SOD活性呈顯著正相關，與POD活性呈極顯著負相關，CAT活性與種子生活力和發芽率相關性不顯著，說明在閩楠種子脫水過程中，SOD對種子的保護作用更大。

3.2 結論

閩楠種子具有頑拗性，其儲藏的最佳含水量為（33.72±0.69）%，種 子 安 全 含 水 量 為（32.17±0.35）%。在整個脫水過程中，SOD對維持閩楠種子活性作用較大。目前生產實踐中通常采用濕沙儲藏閩楠種子，保存期為3～4個月。雖然在保存過程中嚴格控制沙的濕度，但還有大量種子霉變腐爛。還需對閩楠種子脫水過程中的形態結構和生理生化機理進行更深入的研究，為探索其長期保存的方法提供參考。