氧化三甲胺測定方法的研究進展*

張 野，時 景，張 明

(1 九州職業技術學院，江蘇 徐州 221000；2 徐州市康復醫院，江蘇 徐州 221000)

氧化三甲胺(trimetlylamine oxide, TMAO)是一種穩定性較好、易溶于水的小分子胺。不僅存在于海洋生物中，在人體內也可經腸道菌群代謝卵磷脂、膽堿、肉堿等原料生成[1]。人體內TMAO的含量相對較少，但其血漿濃度與人們的飲食習慣、腸道菌群關鍵酶的活性密切相關。近年來，不少研究發現，TMAO在血漿中的高濃度與動脈粥樣硬化面積的大小、腦卒中和心肌梗死的風險增加有關[2-3]；在糖尿病人血漿的檢測中也發現，T2MD患者血漿TMAO濃度及膽堿等前體物質濃度比健康人群水平高要高[4]；在腎損傷動物體內，腎損傷分子-1水平與血液中TMAO含量成正比，提示高水平TMAO可能是促進腎臟纖維化的重要危險因素[5]，因此，TMAO在人體血漿或尿液中水平的升高可能在心血管疾病、糖尿病、腎病等慢性疾病中發揮重要作用，找到快速、精準檢測TMAO的方法尤對于慢性疾病的臨床篩查和診斷顯得尤為必要。TMAO作為慢性疾病標志物的新希望，其研究方法的推進也會為臨床提供更科學的預防手段和治療方法[6]。

1 TMAO的來源與代謝

TMAO是式為 (CH3)3NO 的天然化合物，大量存在于海洋生物中[7]。作為一種有效的蛋白質穩定劑，TMAO可保護海洋動物免受溫度、鹽度、高尿素和靜水壓力的不利影響[8]。TMAO可被海洋動物的內源酶或細菌酶降解為二甲胺(DMA) 或三甲胺 (TMA)，也可將其還原用于評估海產品的質量。在人類中，TMAO主要來源于腸道，腸道微生物群可將飲食中的肉堿、膽堿等含膽堿化合物轉化為TMA，TMA通過被動擴散迅速吸收到門靜脈循環中，然后再通過肝臟中的肝黃素單加氧酶(FMOs)轉化為TMAO[9]。值得注意的是，肝臟FMOs中FMO1的活性比FMO3低10倍，因此，FMO3是負責將 TMA 轉化為 TMAO的主要酶。

TMAO在體內的代謝研究相對較少。有研究發現，40名健康男性在口服TMAO后，血漿中氘標記的d9-TMAO最早可在15 min內被檢測到，1 h后水平升高，給藥后6 h內仍保持較高水平，最終被完全吸收[10]。TMAO被吸收后一般可在24 h內以95%的比例經腎臟從尿液中排出，4%從糞便途徑排出，近1%從呼吸道排出。此外，TMAO也可以被一些含有TMAO去甲基化酶的產甲烷的菌群代謝為二甲胺(DMA)、甲醛、氨和甲烷[11]。

2 TMAO的測定方法

近年來，TMAO在血漿、腦脊液、尿液中水平的升高已經成為獨立預測動脈粥樣硬化、酒精性脂肪肝、阿爾茲海默等疾病等疾病的風險因素。為了盡可能減少TMAO對人類健康的影響，如何精準檢測TMAO的含量尤為關鍵。目前TMAO的測定方法主要有比色法、離子色譜法、液相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫吸附法、核磁共振法等，本文將根據相關的研究結果，總結各方法的研究進展。

2.1 比色法

比色法的檢測方式主要包括直接檢測法和間接檢測法[12]。直接檢測法主要是指雷氏鹽比色法，TMAO與雷氏鹽在酸性條件下相互作用生成紅色沉淀，經含水乙醚和丙酮溶解后清洗、分離，再通過分光光度計測量吸光度值繪制TMAO的標準曲線進行定量[13]。間接檢測法主要是指苦味酸檢測法，通過三氯化鈦(TiCl3)可將TMAO還原成TMA，再將TMA與苦味酸相互反應生成黃色沉淀，比對標準色卡確定TMA的含量，進而換算得到TMAO的含量[14]。

2.2 離子色譜法

離子色譜法是基于離子交換的原理，對色譜固定相上的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子之間進行的可逆交換，用以定性和定量的方法。孫永等[15]使用4 mmol/L硝酸+3%乙腈淋洗，0.9 mL/min的流速進行樣品分離，建立了一種非抑制性離子色譜法，這種方法可同時測定水產品中TMAO及其分解產物，不僅樣品的預處理過程簡單，且加標回收率和精密度也較好，具有較高的實際應用價值。需要注意的是，如果生物樣品中存在Na+、K+、Mg2+等陽性離子，可能會對胺類物質的檢測造成干擾和影響，因此，采用離子色譜法對TMAO進行檢測可能不是最優方法，需要對樣品進行預處理。

2.3 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發生的高選擇性、高特異性識別和結合原理，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法，具有靈敏度高、檢測迅速穩定、重復性好、成本較低的優點。目前，市面上以醫院為研究單位開發的有關TMAO的ELISA方法檢測方法較多，以山東大學為例，2018年山東大學第二醫院發明構建了基于TMAO的多酶組合體系，熒光測定TMAO的檢測方法，該方法克服了TMAO代謝途徑中沒有NAD依賴脫氫酶參與，無法直接耦合的缺點，對于醫院系統的大數據調研和多因子分析具有重要意義。

2.4 液相色譜-質譜聯用法

液相色譜-質譜聯用是利用液相色譜作為質譜的進樣系統，使復雜的化學組分先得到分離，再利用質譜作為檢測器進行定量和定性化學分析方法，是目前被廣泛認可的檢測TMAO的方法，具有靈敏度高、特異性好、可同時分析多個成分及定量準確度高等特點。Wang等[16]采用液質聯用的方法，通過標記TMAO的含量，確定了血液TMAO濃度與心血管疾病之間的關系。Zhao等[17]基于液質聯用并結合穩定的同位素稀釋法，同時測定了人血漿和尿液中膽堿、甜菜堿、TMA、TMAO含量，并通過使用低、中、高水平加標的質量控制，驗證了該測定方法的準確性。Katharina等[18]基于 LC-MS/MS 開發了一種不需要同位素標記就能檢測 TMAO 及其前體膽堿、肉堿和甜菜堿的含量的方法，這種方法速度快、處理量高、消耗的樣品量低，是具有成本效益的方法，有助于在臨床實踐中測量生物標志物，以評估 CVD 發展的風險，或監測疾病進展和干預效果。但也有研究表明，二者聯用的技術雖靈敏度高，但步驟繁瑣，成本也相對昂貴，在衍生環節可能使TMAO發生降解，在一定程度上影響臨床的大規模篩查。

2.5 核磁共振法

核磁共振法主要是利用核磁共振光譜對物質結構進行研究的一種定性和定量的方法[19]。該方法不需要對樣品進行預處理，也不需要購買同位素標記的內標物質，只需要加入緩沖液即可進行檢測分析，在代謝組學的應用中較為廣泛。Wang等[20]基于核磁共振的分析方法，深入研究了臨床血清或血漿樣本中TMAO的水平，以評估心血管疾病風險和個體化飲食監測。Helena等[21]也通過核磁共振法探索研究了魚類的攝入量與人類尿液中TMAO含量的相關性。盡管與質譜法相比，核磁共振分析法可能具有靈敏度不夠等缺點，但該技術具有簡單、快速、準確的特點，因此在血液中含量并不算太低的氧化三甲胺物質的定量分析方面依然可以較方便地使用。

3 結 語

近年來，隨著人們對TMAO的深入研究，越來越發現其在人類健康疾病中的重要作用，對TMAO的預防和監測在臨床中顯得尤為重要。目前，胺類化合物特別是TMAO的含量測定已然成為研究熱點。現有的文獻表明，雖然TMAO的檢測方法仍存在有誤差、步驟繁瑣、成本高等局限性，但比以往研究已取得長足進展。研究顯示，比色法經典，但其靈敏度、重復性較差，易與其他的胺類物質發生反應，導致測量結果不準確，更適合水產生物的檢測；離子色譜法在離子交換過程中容易受液質聯用技術在檢測TMAO上比酶聯免疫法、核磁共振法更有優勢。因為液質聯用對TMAO這種極性大、不具揮發性的胺類物質分離情況更好，也可以實現簡單上機分析、無需沉淀的過程，大大提高了通量，縮短了分析時間；盡管酶聯免疫吸附法看似簡易操作，但不同醫院研發和采用的試劑盒的基線標準并不一致，成本也相對較高；核磁共振分析法作為代謝組學研究的新興技術，雖然省去了很多樣品的前處理過程，但其價格昂貴，操作復雜，需要專業人員對數據進行解讀。總之，我們可能迫切需要研發一種快速、準確、成本低并適合臨床實驗室大規模篩查TMAO的方法，為提前預防TMAO誘發的疾病提供便捷途徑。