冷杉梢斑螟對紅松球果揮發物的觸角電位及行為反應

邵凌松，王雅靜，陳煥文，解丹，宇佳

(1.煙臺市森林資源監測保護服務中心，山東 煙臺 265199；2.東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)是一種球果鉆蛀類害蟲，屬鱗翅目(Lepidopetera)螟蛾科(Pyralidae)梢斑螟屬(Dioryctria)，主要危害球果的基部和中部[1]。近年來，我國東北地區紅松(Pinuskoraiensis)受冷杉梢斑螟的影響，導致紅松種子嚴重減產。由于冷杉梢斑螟整個幼蟲期均在球果內取食發育，隱蔽性較強[2]，防治難度大、成本高，給林業生產帶來了較大的壓力。

紅松主要產于我國東北地區，紅松籽含油量很高，具備較高的工業、藥用和食用價值，具有極高的開發潛力[3]。在種子成熟的過程中，冷杉梢斑螟對其的危害幾乎是毀滅性的，受其危害的球果一般可造成大半果實空殼化，嚴重的可致球果畸形、顆粒無收。

昆蟲對寄主植物的氣味高度敏感，能夠識別來自寄主植物的多種揮發性氣味，并進行精準定位，完成交配產卵等活動[4-8]。利用植物源誘芯對鱗翅目昆蟲的誘集和防治是一種十分有效的手段[9]。本研究基于昆蟲與寄主植物氣味的選擇機理進行冷杉梢斑螟對寄主不同氣味的感受規律研究，以期為冷杉梢斑螟植物源誘芯的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 冷杉梢斑螟被害球果采自黑龍江省勃利縣紅旗林場。將帶有冷杉梢斑螟幼蟲的紅松球果帶回實驗室，用40目的紗網將紅松球果罩住，于室內陰涼通風處放置。每3 d觀察一次，收集從球果中出來的冷杉梢斑螟幼蟲所化的蛹，放于小養蟲盒中。養蟲盒中放入沾有少量無菌水的脫脂棉球，待成蟲羽化后立即將雌雄分開放置待用。

1.1.2 供試球果的采集 用于采集氣味的球果于2020年7月中旬采集，用于收集蛹的球果于2020年8月下旬采集。

1.1.3 供試藥劑 選擇紅松球果中較為常見的6種揮發物(表1)進行觸角電位和行為學試驗。使用液體石蠟將揮發物標準品稀釋為1、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4和1.0×10-5molL-16個濃度梯度的供試溶液，并以液體石蠟為對照進行試驗。

表1 供試藥劑

1.2 方法

1.2.1 紅松球果揮發物的收集和成分分析 將紅松球果連同部分枝條采下，并用封口膜將傷口包裹。將球果放進聚四氟乙烯密封袋內，枝條放在密封袋外，密封袋和枝條間用脫脂棉填充后用鐵絲在密封袋外將其勒緊，以保證收集裝置的氣密性。試驗開始時，打開密封袋的氣閥，用抽氣泵將密封袋內的空氣抽出，再用大氣采樣儀連接洗氣瓶將純凈的空氣充滿密封袋，關緊氣閥，20 min后將密封袋內的空氣抽進蘇馬罐，將蘇馬罐帶回實驗室上機分析。

采用GC17A/5973N(MS)氣質聯用儀測定紅松球果揮發物成分，其中，色譜柱選用DB-5石英毛細管柱(30.00 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣選用高純度氮氣。柱前壓為72.6 kPa，進樣口的溫度為150 ℃，采用分流進樣，柱流速設置為1.33 mLmin-1，進樣量為0.2 μL。初始溫度為40 ℃，并以5 ℃min-1的速率升溫，升到90 ℃，再以8 ℃min-1的速率升溫，升到250 ℃后，保持該溫度2 min。MS條件，EI電離，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍(m/z)50～500 amu，掃描時間0.14 s。采用Xcalibur軟件，對比查詢NIST98.L譜庫，結合色譜保留時間進行成分鑒定。通過面積歸一法計算每種揮發物的相對含量。

1.2.2 觸角電位測定 取活躍的冷杉梢斑螟成蟲，用解剖刀將頭部切下，用導電膠將2根金屬電極與觸角兩端相連，而后將連有觸角的電極與觸角電位儀相連。為了減小試驗過程中因觸角失活造成的誤差，每隔0.5 h換用新的觸角，來保證昆蟲觸角的活性。在巴斯德管中放置一片干凈的濾紙片，通過移液器將待測溶液滴至濾紙片上，固定金屬電極以及送氣管，以確保揮發物在巴斯德管中被均勻地運送至觸角，通氣流量為300 mLmin-1。開始測定時，每次在濾紙上滴10 μL樣品溶液，每種樣品每個濃度各重復測定5次，同一試劑的刺激順序按低濃度到高濃度進行，同時取稀釋揮發物溶液所用的液體石蠟為對照進行對比試驗，將前后2次處理測定值的平均值減去對照組所得數值即為EAG(mV)相對反應值。

1.2.3 行為學測定 利用Y型嗅覺儀開展進一步的試驗，測定冷杉梢斑螟成蟲對不同揮發物的選擇行為。在試驗開始前，用移液槍分別將20 μL樣品和對照組溶液滴在2 cm×2 cm的濾紙片上，并將濾紙片放入氣味源放置瓶。控制氣流，通氣15 s后將試蟲放在引蟲口處將成蟲引入Y型管中，觀察成蟲在5 min內的反應，若進入樣品一側的臂，并在內移動超過2.5 cm，說明該化合物對其有引誘作用；若進入對照組一側的臂，并在內移動超過2.5 cm，說明該化合物對其有驅避作用。否則即為無反應。每次測試后要更換清洗后的樣品臂和對照臂，每只供試昆蟲只使用1次，不可多次使用。

1.2.4 數據處理 試驗所得的EAG相對反應值多重比較采用Duncan檢驗；對嗅覺行為反應的結果進行卡方檢驗。數據分析均使用 IBM SPSS Statistics 26軟件。

2 結果與分析

2.1 紅松球果主要揮發物成分及相對含量分析

通過在林間對紅松球果揮發物的收集與分析，共鑒定出15種化合物(表2)。其中，萜烯類物質種類最豐富，有13種；烷烴類物質相對較少，只有2種。其中(+)-α-蒎烯相對含量最高，為40.50%，其次為月桂烯和β-蒎烯，相對含量分別為13.69%和11.57%。

表2 紅松球果主要揮發物相對含量

2.2 冷杉梢斑螟對紅松球果主要揮發物的EAG反應

冷杉梢斑螟對紅松球果6種主要揮發物及其不同濃度的相對EAG反應值如表3所示。

表3 冷杉梢斑螟成蟲對6種揮發物的EAG反應

2.3 行為學反應

依據EAG值測定結果，選出了具有明確EAG反應的各種濃度揮發物，開展進一步的行為反應測定(表4)。結果表明： (+)-α-蒎烯除1.0×10-1molL-1濃度外其他濃度對雌蟲均顯著吸引(P<0.05)，在1.0×10-1molL-1、1.0×10-2molL-1和1 molL-1下對雄蟲顯著吸引(P<0.05)；α-蒎烯在1.0×10-3molL-1到1 molL-14個濃度梯度下均對雌蟲顯著吸引，對雄蟲在各個濃度下均不表現出選擇差異(P<0.05)；(-)-β-蒎烯在1.0×10-3molL-1和1.0×10-2molL-1濃度下對雌蟲顯著驅避，在1.0×10-1molL-1和1 molL-1濃度下對雄蟲顯著吸引(P<0.05)；β-蒎烯在1.0×10-2molL-1、1.0×10-1molL-1和1 molL-1濃度下對雌蟲顯著吸引，在1.0×10-2molL-1濃度下對雄蟲顯著吸引(P<0.05)；月桂烯1.0×10-4molL-1到1 molL-15個濃度梯度下均對雌蟲顯著吸引，在1.0×10-2molL-1到1 molL-13個濃度梯度下均對雄蟲顯著吸引(P<0.05)；3-蒈烯在1.0×10-3molL-1到1 molL-14個濃度梯度下均對雌蟲顯著吸引，1.0×10-4molL-1到1 molL-15個濃度梯度下均對雄蟲顯著吸引(P<0.05)。

表4 冷杉梢斑螟成蟲對6種揮發物行為學卡方檢驗結果

總體看，(+)-α-蒎烯、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和3-蒈烯5種揮發物對冷杉梢斑螟雌蟲有吸引作用，(-)-β-蒎烯對冷杉梢斑螟雌蟲有驅避作用。(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和3-蒈烯5種揮發物對冷杉梢斑螟雄蟲有吸引作用。

3 結論與討論

植物和昆蟲千百萬年來協同進化，昆蟲已經進化出來一套完整的系統，尋找適合的場所進行交配和產卵[10]。植物同樣會散發一些氣味來吸引天敵前來[11]。植物揮發出的分子量較低的小分子化合物會和昆蟲觸角感器上的受體相結合，從而將氣味以電信號的形式傳送，以此調控昆蟲的行為[12]。在整個昆蟲尋找寄主的過程中不單單是一種氣味起作用，而是由植物所散發出來的各種揮發性化合物組成的氣味網絡共同起作用。揮發性化合物不一定對昆蟲都有吸引作用，也有一些物質對它們有驅避作用[13]。通過對冷杉梢斑螟在東北地區主要寄主——紅松球果的揮發物分析，共鑒定出15種化合物。其中，共有13種萜烯類物質和2種烷烴類物質，均為較常見的紅松揮發物。這些揮發物均不是紅松球果所特有的，在紅松枝條和主干上也比較常見[14-17]。所以，冷杉梢斑螟在選擇寄主時，關鍵的因素可能是某種物質單位時間的釋放量及不同揮發物之間的配比[18]。如紅松主干的(+)-α-蒎烯相對含量和本試驗測得的紅松球果中的相對含量十分接近，但總物質種數及其他物質的相對含量相差較大[19,20]。

試驗研究發現，所選的6種化合物均能在較高濃度條件下引起冷杉梢斑螟雌雄成蟲的EAG反應，但對同種物質的不同濃度感受差異較大。α-蒎烯、(-)-β-蒎烯及月桂烯引發雄蟲EAG反應的起始濃度較大，β-蒎烯引發雌蟲EAG的起始濃度較大，這可能與冷杉梢斑螟雌雄成蟲在尋找寄主過程中所擔任的角色及雌雄成蟲觸角感受氣味的感器組成有關，對雌雄成蟲來說，它們感受寄主揮發物的濃度也有較大差異，這極可能和它們的求偶和產卵行為存在一定的關聯[21]。因為雌蟲要為下一代選擇適宜的寄主，而雄蟲在尋找寄主的同時，更多的是要尋找雌蟲。進一步Y型嗅覺儀行為學試驗發現，(+)-α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和3-蒈烯對冷杉梢斑螟雌雄成蟲均有吸引能力，α-蒎烯只對雌蟲表現出吸引能力，(-)-β-蒎烯對雌蟲表現為驅避，對雄蟲表現為吸引；紅松球果中即存在對冷杉梢斑螟成蟲有吸引作用的物質，也存在驅避作用的物質，這或許也是植物的一種防御手段。在復雜的氣味網絡系統中，冷杉梢斑螟是怎么定位寄主的還需要后續進行大量的研究工作進行驗證。