氧糖剝奪/再灌注損傷小膠質細胞通過上調胸腺素β4影響PI3K/AKT信號通路*

熊娟 龐月珊 吳憂 任海波

(南充市中心醫院 1.特需醫療科；2.老年科；3.神經外科，四川 南充 637000)

急性腦梗死在全世界都具有較高發病率、高致殘率和高死亡率。急性腦缺血發生后，腦中血管神經單元受到損傷，及時恢復腦血流是目前主要治療措施之一，但可能誘發缺血/再灌注損傷。缺血再灌注損傷后小膠質細胞迅速活化，可釋放炎性介質及細胞因子再次損傷腦組織[1]?；罨男∧z質細胞同樣在血管生成中起著重要的作用[2]，但研究小膠質細胞對腦血管的影響較少。Tβ4是由43個氨基酸構成的多肽具有廣泛的生物活性，包括神經保護[3]，誘導中樞和外周神經系統的血管生成[4]。研究顯示外源性Tβ4可通過PI3K/AKT/eNOS信號通路刺激內皮祖細胞定向遷移[5]，在急性和慢性缺血模型中對內皮祖細胞都起到保護作用[6]。PI3K/AKT信號通路是血管新生重要的信號通路，其激活后可以上調下游的mTOR、eNOS、HIF1α和VEGF等表達促進血管新生[7-10]。PI3K/AKT通路在中樞神經系統損傷和修復中起到核心作用。全腦缺血后小膠質細胞高表達Tβ4[11]，且Tβ4與PI3K/AKT通路相關[5, 12-13]，膠質源性的Tβ4是否通過PI3K/AKT通路參與局灶腦缺血/再灌注損傷后的修復尚不清楚。本研究旨在探討缺血再灌注/損傷后小膠質細胞中Tβ4的表達變化及其對PI3K/AKT通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 21只成年雄性SPF級SD大鼠，體重(200±20) g (上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)20130016)。大鼠被飼養在特定的無病原體的條件下，自由獲得食物和水。動物實驗獲得四川省實驗動物學會倫理委員會批準(2021-05)，并按照動物實驗機構指導原則進行。

1.2 局灶腦缺血/再灌注損傷模型、細胞氧糖剝脫/再灌注損傷模型 參考文獻制作局灶腦I/R模型[14]，動物隨機分為假手術組(Sham組)(n=6)、模型組(I/R組)(n=15)。先用3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。取仰臥位，備皮消毒后沿頸正中線切開皮膚2～3 cm，鈍性分離皮下組織及右側頸總、頸內、頸外動脈。用絲線暫結扎頸外動脈，經總動脈，并在頸總動脈遠端置線并打結，便于固定栓線。夾閉頸內動脈，用眼科剪在頸總動脈兩個綁線間剪個小口，插入栓線，打開夾閉頸內動脈的動脈夾，栓線插入到距離頸內、頸外分叉口18～20 mm處，直到出現輕微阻力，表明大腦前動脈和大腦中動脈起源處被阻斷，消毒縫合切口并置于37℃恒溫實驗臺上，直至蘇醒。缺血2 h后，輕輕向外提拉線栓10 mm，實現再灌注。假手術組織切開鈍性分離，不結扎血管和植入線栓。行為測試參照Zea-longa評分法[14]評價模型是否成功，9只成模大鼠再灌注后分別于24(I 2 h/R 24 h)、48(I 2 h/R 48 h)、72 h(I 2 h/R 72 h)麻醉處死大鼠取腦進行后續實驗(n=3)。OGD/R模型是根據文獻[15]制作，將制備好的BV2細胞(購于中國典型培養物保藏中心細胞共享平臺)6×105/mL接種于無血清無糖DMEM培養基中并置于 1% O2、5% CO2、94% N2的三氣培養箱中分別孵育2、4、6 h；再灌注時，首先去掉無血清無糖的 DMEM 培養基，再加入含10%血清的DMEM F12膠質細胞培養基中，分別在24、48、72 h進行檢測。

1.3 Tβ4 shRNA轉染 使用轉染效率較高的Tβ4 shRNA序列：正義鏈5′-GGTTGGATCAAGTTTAA AT-3，反義鏈 5′-ATTTAAACTTGATCCAACC-3′。對照shRNA由一個混亂的序列組成，不能針對任何已知的細胞mRNA。免疫熒光分析評價檢測基因干擾后Tβ4表達，然后將細胞用于OGD/R造模。分為對照組、OGD/R組、shRNA Tβ4+Control組、shRNA Tβ4+OGD/R組、Control shRNA+Control組、Control shRNA+OGD/R組。對照組細胞置于含10%血清的DMEM F12膠質細胞培養基中37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.4 蛋白免疫印跡實驗 使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑RIPA裂液提取細胞蛋白。采用BCA法測定蛋白質濃度，蛋白變性，并按50 ug/孔標準向12%的SDS-PAGE分離膠加入樣本并進行電泳1 h，轉膜45 min。脫脂奶粉封閉 2 h，洗膜后與稀釋的兔抗AKT、兔抗磷酸化AKT (Ser473)、兔抗PI3K、兔抗磷酸化PI3K (1∶800，CST)和小鼠抗β-actin(1∶1000，碧云天生物技術公司)一抗共孵育4℃過夜；復溫1 h，洗膜后與辣根-過氧化物酶標記二抗(碧云天生物技術公司)室溫孵育 1 h。膜上滴加ECL曝光液，在Bio-Rad儀對條帶進行掃描并使用“Quantity one”軟件分析。

1.5 細胞免疫熒光、免疫組化實驗 細胞免疫熒光：去掉培養基，加入4%多聚甲醛固定10～15 min，使用PBS反復清洗3次清洗后加入Tβ4一抗4℃孵育過夜(1∶400, SANTA CRUZ), 復溫1 h，洗滌后使用山羊抗小鼠FITC抗體(1∶1000，碧云天生物技術公司)避光室溫孵育2 h, DAPI染核色(100 ng/mL) 10 min，最后顯微鏡熒光顯微鏡成像。免疫組織化學：將大鼠麻醉后經心臟灌注生理鹽，再灌注4%多聚甲醛，取大腦經過固定、脫水后石蠟包埋。將病變部位大腦切成6 μm厚的切片。經常規脫蠟水化，室溫用3%雙氧水作用10 min滅活內源性過氧化物酶。將Tβ4抗體按1∶200稀釋，4℃孵育過夜，洗滌后脫脂奶粉封閉2 h，再次洗滌后加入HRP標記的二抗，室溫靜置30 min，加DAB顯色液，顯色5～10 min，用蘇木精復染2 min，乙醇分化、脫水、透明，樹脂膠封片。OLYMPUS PM20顯微鏡和TCFY-2050病理系統下觀察和成像。使用ImageJ對免疫組化圖片和免疫熒光圖片進行量化。

1.6 統計學分析 使用GraphPad Prism 9.1軟件進行數據分析并做統計圖，兩兩比較采用Unpairedttest檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 I/R損傷后大腦皮質Tβ4表達水平升高 免疫組化檢測腦組織中Tβ4的表達結果顯示，與假手術相比，大鼠局灶性腦缺血/再灌注的24、48、72 h大腦皮層均有Tβ4表達增多，根據細胞形態可初步推斷Tβ4在神經元和膠質細胞高表達，梗塞部位以及梗塞周圍Tβ4的表達以膠質細胞為主(圖1A)。對免疫組化進行平均光密度值統計分析發現，與Sham組比較，I 2 h/R 48 h Tβ4表達水平顯著升高 (P< 0.0001)，見圖1B。

圖1 局灶腦缺血2 h/再灌注24、48、72 hTβ4表達情況 Figure 1 The expression of Tβ4 at focal cerebral ischemia 2h/reperfusion 24, 48, 72 h注：A.各組大鼠腦皮質Tβ4表達情況(標尺=50 μm)；B.各組平均光密度值。與Sham組比較，①P<0.05

2.2 BV2細胞在氧糖剝奪/再灌注損傷后高表達Tβ4 免疫熒光法檢測BV2細胞OGD/R損傷后Tβ4蛋白的表達結果顯示，與對照組相比，氧糖剝奪2、4、6 h復氧48 h組Tβ4表達較多， 其中OGD 6 h/ R 48 h組表達最多(P<0.0001)。OGD 2 h/R 72 h和OGD 4 h/ 24 h組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。OGD 2 h、OGD 4 h和OGD 6 h組Tβ4都是再灌注后48 h達到峰值，表明Tβ4蛋白表達與氧糖剝奪/再灌注的時間有一定的相關性。見圖2。故我們選擇在該實驗中Tβ4表達相對較多的OGD 6 h/R 48 h組進行后續干預實驗。

圖2 Tβ4在不同組的BV2細胞中表達Figure 2 The expression of Tβ4 in BV2 cells in different groups 注：A、B為Tβ4免疫熒光染色(標尺=50 μm)；C.平均光密度。與對照組比較，①P < 0.05

2.3 BV2細胞表達的Tβ4調節PI3K/AKT信號通路表達 為了驗證BV2表達的Tβ4對PI3K/AKT通路的影響，我們選擇在該研究中Tβ4表達相對較多的OGD 6 h/R 48 h組進行干擾。結果顯示，使用shRNA Tβ4干擾BV2 細胞在進行氧糖剝奪/再灌注實驗，其中Tβ4蛋白表達明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3A、B。使用對照序列轉染組與OGD 6 h/R 48 h組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。同時使用WB方法檢測PI3K/AKT通路蛋白表達發現，與對照組相比，OGD 6 h/R 48 h組p-PI3K/PI3K比值顯著升高(P<0.05)，而Tβ4 shRNA OGD 6 h/R 48 h組的p-PI3K/PI3K比值較OGD 6 h/R 48 h組明顯降低(P<0.05)，見圖3C、D。與對照組相比較，OGD 6 h/R 48 h組p-AKT/AKT比值較高(P<0.05)，但Tβ4 shRNA干預后，降低了p-AKT/AKT比值(P<0.05)，見圖3E。結果表明，BV2細胞在OGD/R損傷后高表達的Tβ4可能調控PI3K/AKT信號通路。

圖3 BV2細胞表達的Tβ4 對PI3K/AKT 通路影響Figure 3 The effect of Tβ4 expressed in BV2 on PI3K/AKT pathway注：A、B為Tβ4基因干擾后Tβ4蛋白表達情況及平均光密度值(標尺=50 μm)；C.WB檢測p-AKT、 AKT、p-PI3K、PI3K、β-actin表達；D、E分別為p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K統計分析。與對照組比較，①P<0.05

3 討論

小膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞，可參與免疫調節[16]和腦組織發育[17]。傳統上認為小膠質細胞的活化在缺血性腦卒中是有害的，抑制小膠質細胞活化治療腦卒中的方法得到廣泛研究。然而，越來越多的證據表明，小膠質細胞的激活對神經發生、血管生成和突觸重塑也至關重要，促進腦缺血后的功能恢復[18]。目前小膠質細胞對卒中后血管生成的影響已經成為研究熱點[18-20]。Kubota等[21]研究顯示在缺失小膠質細胞的小鼠視網膜中，血管的分支明顯減少。Ding等[2]認為活化的小膠質細胞可導致內皮細胞緊密連接破壞，同時促進內皮生長因子分泌促進新生血管的形成。Zhu等[19]研究也發現小檗堿通過AMPK信號通路調節小膠質細胞極化促短暫性大腦中動脈閉塞模型血管生成。

局灶腦缺血/再灌注損傷后，在腦缺血區域周圍有小膠質細胞增多[22]，但該區域小膠質細胞與血管生成的關系尚不清楚。Tian等[23]觀察到BV2小膠質細胞顯著促進毛細血管樣管形成和腦微血管內皮細胞遷移，并且這種作用與酪氨酸蛋白激酶A相關。在本研究中，我們發現局灶腦缺血/再灌注損傷后位于大腦皮質區周圍區域的小膠質細胞Tβ4水平較高，尤其是在I 2 h/R 48 h組，同時我們體外實驗證實BV2細胞在OGT/R造模后同樣有Tβ4高表達。使用shRNA 干擾Tβ4表達后，p-PI3K、p-Akt表達也相應減少，但PI3K/AKT通路的表達并未完全受到抑制，說明Tβ4不是缺血/再灌注損傷后影響PI3K/AKT通路的唯一因子。Kim等[24]也觀察到全腦缺血后可誘導海馬齒狀回小膠質細胞Tβ4高表達，與本研究結果相似。綜上可知，腦缺血再灌注損傷后小膠質細胞有Tβ4表達，并且可能參與PI3K/AKT通路調節。

PI3K/AKT信號通路是調節內皮細胞生存能力及血管再生的關鍵通路[25-26]，也是參與局灶腦缺血/再灌注損傷修復的關鍵通路。Trenkwalder等[13]研究發現，肌肉注射Tβ4治療14 d，血管生成增加，且與PI3K/AKT通路相關。此外，另一項研究也表明Tβ4可以通過激活AKT/eNOS促進血管生成[27]。Tβ4激活PI3K/AKT通路后，可調控eNOS表達，進而刺激內皮祖細胞的定向遷移和分化[5,12,27]。研究顯示Tβ4不僅能增強內皮祖細胞的活力、血管生成能力和遷移能力，還能使內皮祖細胞高表達血管內皮生長因子A、血管緊張素及血管生成素受體促進血管生成[28]。Tβ4也能通過激活內皮蛋白水解系統，抑制內皮細胞粘附，促進內皮細胞的遷移和毛細血管形成[29]。綜上，我們推測局灶腦缺血/再灌注損傷后小膠質細胞高表達Tβ4也可能通過調節PI3K/AKT信號通路影響血管生成，促進局灶腦缺血/再灌注損傷的修復。接下來我們將進一步研究Tβ4對PI3K/AKT通路下游信號因子及血管生成的影響，進一步揭示小膠質細胞對局灶腦缺血/再灌注損傷后血管生成的影響機制。

4 結論

局灶腦缺血/再灌注損傷后，大腦皮質小膠質細胞高表達Tβ4，并且小膠質細胞高表達的Tβ4可能通過PI3K/AKT影響腦缺血/再灌注損傷的修復。