一株同步糖化發酵纖維素產乙醇的尖孢 鐮刀菌的篩選

周 泉，湛佳佳,2，李 璧，張志旭，秦 丹，曾 璐*

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2.遵義醫科大學醫學與科技學院 醫養健康學院， 貴州遵義 563000；3.湖南農業大學 園藝學院，湖南長沙 410128； 4.湖南農業大學園藝作物種質創新與新品種選育教育部工程研究中心，湖南長沙 410128）

甘蔗是我國主要的制糖原料，由此每年會產生約3000萬t的副產物，若將這類木質纖維素資源合理利用，將會產生巨大的經濟價值[1]。甘蔗渣作為一類富含纖維素、半纖維素以及大量殘糖的原料，成為了生產纖維素乙醇的理想材料[2]。現階段大多數的纖維素乙醇研究，都需經過水解、糖化、發酵等多個步驟處理，工序費時費力，不僅無法實現資源的充分利用，甚至因化學試劑使用過多導致環境污染，成本過高等問題。如果能得到一株具備纖維素乙醇轉化能力的菌株，將多個發酵步驟置于同一個發酵體系中進行，即采用單菌株進行甘蔗渣纖維素的同步糖化發酵(Simultaneous Sacchrification and Fermentation，SSF)，便能很好地解決上述問題。此外，在水解液中約有30%以木糖為代表的五碳糖難以被微生物利用，這也成為制約纖維素乙醇提高的瓶頸，因此對微生物的選擇就顯得至關重要。目前已知少數尖孢鐮刀菌菌株能夠附著在木質纖維素底物上產生纖維素酶和半纖維素酶使其降解，也有部分菌株能夠使單糖轉化生成乙醇。若能獲得一株具備纖維素降解、發酵單糖生成乙醇，同時能夠利用五碳糖的菌株材料，對于利用單菌株進行同步糖化發酵生產乙醇的研究，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗室從國內外收集保藏的10株尖孢鐮刀菌菌株，均已完成菌種鑒定，具體信息見表1。

表1 尖孢鐮刀菌菌株信息

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

木質素標準品：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；纖維素標準品：湖南國倫美生物科技有限公司；木聚糖標準品：上海源葉生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器

IRAきnity-1型傅里葉紅外光譜儀：日本島津公司；UV-1800型紫外可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；SBA-40E型生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所。

1.3 培養基配制

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養基：羧甲基纖維素鈉2 g，瓊脂18 g，pH值6.0，蒸餾水溶解并定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，待培養基凝固后，在培養皿中心打一個直徑0.5 cm的圓孔，備用。

濾紙崩解培養基：磷酸二氫鉀2 g、硫酸銨4 g、硫酸鎂0.1 g、蛋白胨1 g和酵母膏10 g，加入蒸餾水1 L攪拌至完全溶解。每瓶50 mL分裝至250 mL三角瓶中，并加入6條1 cm×3 cm濾紙條，滅菌備用。

發酵產酶培養基：甘蔗渣30 g，羧甲基纖維素鈉5 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g·L-1，硫酸鎂 0.2 g，硫酸銨3 g，蒸餾水溶解并定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

木糖發酵培養基：木糖50 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 1 g、蒸餾水溶解并定容至1 L，分裝后滅菌。

甘蔗渣發酵培養基：已預處理的甘蔗渣50 g、硫酸銨1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鈣1 g，加入蒸餾水1 L攪拌至完全溶解，分裝后滅菌。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株篩選

菌種初篩，參考王瑋[3]的剛果紅平板染色法，復篩參考吳慶珊[4]的濾紙片崩解法。

1.4.2 酶活力測定

接種2 mL種子液于100 mL發酵培養基中，28 ℃、 150 r·min-1搖瓶培養，每天測定幾種主要纖維素酶的酶活。取發酵樣液5000 r·min-1離心5 min，取上清液為待測液，每株菌設3個平行。內切葡聚糖酶（CMCA）酶活測定參照QB 2583—2003[5]附錄B的方法；外切葡聚糖酶（CBH）酶活測定參照孔芹等[6]的研究方法；β-葡聚糖酶酶活測定參照 QB/T 4481—2013的方法[7]；木聚糖酶酶活測定參照GB/T 23874—2009的方法[8]。

1.4.3 發酵五碳糖產乙醇性能測定

分別接種2 mL待測菌株種子液至100 mL木糖發酵液體培養基、PDB培養基，28 ℃、150 r·min-1搖瓶培養7 d，參考馮東等[9]的生物傳感法測定乙醇含量。

1.4.4 同步糖化發酵甘蔗渣產乙醇性能測定

（1）發酵底物預處理。甘蔗渣原料預處理：將甘蔗渣自然風干后粉碎，過100～200目篩，使粒徑在0.15～0.75 mm，于80 ℃烘干至恒重；底物去糖處理：參考陳楨[10]的甘油-過碳酸鈉預處理法。

（2）甘蔗渣同步糖化發酵。將5 mL新鮮種子液分別接種至經去糖、未去糖處理的甘蔗渣發酵培養基中，28 ℃、150 r·min-1搖瓶培養7 d。每日跟蹤監測殘糖及乙醇含量。發酵結束后，測定降解率。乙醇轉化率和降解率的計算公式分別為

式中：c為乙醇濃度，g·L-1；v為酶解液的體積，L；m為甘蔗渣的質量，kg。

式中：m1為發酵前甘蔗渣重量，g；m2為發酵后剩余甘蔗渣的重量，g。

1.5 底物成分分析

取發酵殘渣，用蒸餾水洗滌至中性，80 ℃烘干至恒重。取發酵前后的甘蔗渣樣品及纖維素、半纖維素、木質素標準品各0.6 mg，與59.4 mg的溴化鉀粉末混勻，在研缽中充分研磨至粒徑 ≤2 μm，用傅里葉紅外光譜儀（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR）在1.2 Ton壓力下作用30 s， 壓制出均勻透明無裂痕的壓片，光譜波數掃描范 圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數64次。

1.6 數據分析

采用Excel和SPSS軟件進行數據分析，Origin 2018進行圖表制作。

2 結果分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 剛果紅平板染色初篩

剛果紅與CMC-Na反應可生成紅色復合物，但不與降解后的單糖發生反應，根據水解圈的大小可初步判斷菌株的纖維素水解能力，水解能力越強，水解圈直徑越大。結果見圖1。

圖1 剛果紅平板染色結果圖

由圖1可知，各菌株均出現明顯的水解圈，且F1、F5、F6、F7、F8、F9和F10菌水解圈直徑均大于4.00 cm，其中F10效果最佳，達到4.5 cm。

2.1.2 濾紙崩解試驗復篩

為保證試驗結果的準確性，對初篩菌株F1、F5、F6、F7、F8、F9和F10進行濾紙片崩解的復篩，結果如圖2所示。

圖2 濾紙崩解試驗結果圖

由圖2可知，10個菌株三角瓶中的濾紙條都不同程度被降解，其中F2、F4、F6和F9菌株的降解效果不明顯，濾紙無明顯變化；F1、F5、F7菌株使濾紙邊緣輕微降解；F3、F8菌株有一定的降解效果，可使濾紙降解成小圓片；F10菌效果最明顯，可使濾紙片降解成糊狀。由此表明，F10菌的纖維素降解能力最佳，可用于后續試驗的同步糖化發酵試驗 研究。

2.2 菌株產酶性能

微生物酶活力大小決定著纖維素的降解效果，木質纖維素的水解由纖維素酶和半纖維素酶起主要作用，其中，纖維素酶主要包括內切葡萄糖酶、外切葡萄糖酶和β-葡萄糖苷酶，半纖維素酶主要以木聚糖酶為主。如圖3所示，F10酶系統較為完全，內切酶、外切酶、β-葡聚糖酶的酶活力分別為15.32 U·mL-1、23.56 U·mL-1、10.65 U·mL-1，與同類型的纖維素降解菌株酶活力效果類似；而F10的木聚糖酶活力值達到249.05 U·mL-1，顯著高于其他酶的活力值。

圖3 F10酶活力情況圖

2.3 發酵五碳糖產醇性能

木質纖維素水解產物中約有30%的五碳糖（主要由半纖維素水解而得）。而自然界中僅有少數的微生物能利用木糖生成乙醇，這也成為了纖維素乙醇產量高低的決定因素。本試驗以木糖為底物，測定F10對五碳糖的產醇性能。結果如圖4所示，F10菌在PDB中生長狀況良好，使木糖培養基出現明顯渾濁，表明F10可在木糖為唯一碳源的培養基中生長代謝，其乙醇產量可達16.84 g·L-1。該試驗結果明顯高于范金霞等[11]的研究，在纖維素轉化方面具有良好前景。由此表明F10具備良好的同步糖化發酵 潛力。?

圖4 F10不同培養基生長情況及發酵木糖產醇情況圖

2.4 尖孢鐮刀菌同步糖化發酵甘蔗渣的產醇性能

以甘蔗渣為底物，用F10進行同步糖化發酵試驗，并以去糖甘蔗渣作為對照，以驗證在無殘糖的影響下，對甘蔗渣具有同步糖化發酵的效能。如圖5所示，在未經去糖處理的甘蔗渣中，葡萄糖起始含量為 2.89 g·L-1，呈先增長后下降的趨勢，第2天以后趨近于0 g·L-1，但乙醇含量仍逐步增長，第4天時達到峰值9.5 g·L-1，轉化率為19.0 g·kg-1，降解率可達28%，表明菌株F10對甘蔗渣的降解和糖醇轉化效果良好。此外，在無初始糖的情況下，乙醇的含量逐步增長，轉化率可達8.4 g·kg-1，但葡萄糖的含量卻在整個發酵過程中均無明顯的增減變化，表明菌株F10在發酵過程中，在對甘蔗渣纖維素進行降解的同時，將發酵體系中的單糖同步轉化生成乙醇，這也進一步驗證了F10具備同步糖化發酵的能力。

圖5 甘蔗渣發酵過程中葡萄糖和乙醇的含量變化圖

2.5 FTIR分析同步糖化發酵對甘蔗渣成分的影響

FTIR譜圖根據特征吸收峰的位置、強度和形狀表征化合物官能團的振動與轉動，不僅可用于鑒別分子結構的歸屬還可進行定量分析。甘蔗渣是復雜的生物質材料，為消除多種化合物基團相互作用的干擾，對甘蔗渣的3種主要成分纖維素、半纖維素和木質素標準品的譜圖位置、峰形進行認定。在 4000～400 cm-1波數段進行FTIR掃描測定，并根據參考文獻[12]檢索峰谷，進行特征峰的歸屬分析，同時對發酵前后的甘蔗渣樣品進行測定。結果如圖6、表2所示。

圖6 甘蔗渣發酵前后的傅里葉紅外光譜圖

表2 FTIR譜圖的相關峰谷歸屬分析

甘蔗渣樣品中包含了OH、CH、C=O和C-O-C等一系列化學基團結構，發酵前的甘蔗渣在木質素特征峰1582 cm-1、1417 cm-1、1125 cm-1和630 cm-1處波谷突出振動能力強，而纖維素與半纖維素不明顯，根據FTIR光譜振動強弱與化學標定數據一致性可知[13]，木質素在未發酵的甘蔗渣中占比較大。而在發酵后的樣品譜圖中，3種組分的吸收峰發生了顯著變化，木質素的特征峰在1582 cm-1、 1417 cm-1處的振動消失，同時630 cm-1、1130 cm-1吸收峰振動強度明顯降低，說明木質素在同步糖化發酵過程中苯環骨架的C=O、C-H面內彎曲發生了氧化裂解，OH面外彎曲，C—O—C伸縮結構減少，表明木質素在發酵后含量降低。而發酵后出現振動增強的吸收峰歸結為半纖維素C—O伸縮、C=O不對稱彎曲和C=O伸縮振動，以及以1047 cm-1、 1730 cm-1、1630 cm-1為半纖維素特征的吸收峰增多。3種組分發酵前后的變化趨勢表明，甘蔗渣中的木質素在同步糖化發酵過程中被大量降解但仍有一定殘留，推測F10在同步糖化發酵的過程中，對木質素有較好的降解優勢，與木質素形成的高分子抗性屏障被解聚后，纖維素和半纖維素的空間結構暴露出來，為菌株的同步糖化發酵提供了良好的底物條件。

3 結論

本研究通過剛果紅染色、濾紙片崩解試驗篩選獲得一株具有較強纖維素水解能力菌株FOCmh2-2，水解圈直徑達到4.5 cm，可使濾紙完全水解成糊狀。其纖維素酶系統完全，酶活力良好，具備良好的五碳糖轉化能力。隨著發酵的進行，各纖維素酶與乙醇的生成量呈正相關增長，其中木聚糖酶的酶活最高，達到249.05 U·mL-1，可使半纖維素快速水解為五碳糖，且FOC-mh2-2能代謝普通菌株無法利用的五碳糖，可使純木糖的產醇量達16.84 g·L-1。 且能在底物殘糖近乎為0的條件下進行木質纖維素發酵，具備同步糖化發酵效能。經FTIR分析，在同步糖化發酵過程中木質素在發酵后含量降低，推測菌株在發酵過程中使木質素降解，改變了原料難以利用的特殊結構，使發酵快速進行。本試驗篩選所得菌株FOC-mh2-2可同步實現木質纖維素的高效水解與糖化，可作為“一步法”乙醇發酵工藝的改良野生型菌株，為纖維素乙醇生產降低成本、提質、增效提供參考。