液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜中甲拌磷殘留量的不確定度評定

張屹璇，余 浪*，杜麗思，阮寶慧，劉鵬芳，李彥芹

（1.云南智農(nóng)高新技術(shù)有限公司，云南昆明 650600；2.云南云天化現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，云南昆明 650600）

甲拌磷是一種在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常規(guī)檢測的農(nóng)藥。甲拌磷及其代謝物是一種高毒性農(nóng)藥，一旦人體過量攝入，則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、呼吸衰竭等[1]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》 （GB 2763—2016）[2]中規(guī)定，蔬菜中甲拌磷最高殘留限量僅為0.01 mg·kg-1，因此保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性就相當(dāng)重要。在查閱大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，氣相色譜-質(zhì)譜法測定芹菜中甲拌磷的不確定度評定已有報(bào)道[3]。另外，也有關(guān)于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中吡蟲啉、甲霜靈、多菌靈等農(nóng)藥殘留量的不確定度評定的相關(guān)報(bào)道[4-6]，但具體的測定方法均與標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中331種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.121—2021）[7]不同。另一方面，采用標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.121—2021測定果蔬中甲拌磷殘留量的不確定度評定未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.121—2021測定陽性黃瓜樣品中甲拌磷的殘留量，在稱量樣品后，用乙腈試劑勻漿提取，加入QuEChERS鹽包，通過鹽析離心，取上層清液，經(jīng)QuEChERS凈化管凈化，過有機(jī)相微孔濾膜后，裝入進(jìn)樣小瓶中，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，采用外標(biāo)法定量。本實(shí)驗(yàn)參照《化學(xué)分析測量不確定度評定》 （JJF 1135—2005）[8]以及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]對整個(gè)測定過程中有可能產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行來源分析和對應(yīng)數(shù)據(jù)的計(jì)算，為本實(shí)驗(yàn)室農(nóng)藥殘留檢測質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲拌磷陰性和陽性黃瓜樣品。

乙腈（HPLC，Merck）；甲醇（HPLC，Merck）； 甲酸（HPLC，Thermo）；甲醇中甲拌磷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1000 μg·mL-1，壇墨質(zhì)檢）；QuEChERS萃取鹽包（Agilent）；QuEChERS通用型凈化管（Agilent）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX Triple Quad 4500）；多功能高速離心機(jī)（Beckman Allegra X-30）；均質(zhì)機(jī)（IKA T25）；電子天平（METTLER TOLEDO ME204）；Polar C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，2.6 μm）；漩渦混勻器（IKA MS 3）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和中間溶液的配制

（1）100 μg·mL-1甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用1 mL的A級單標(biāo)線移液管準(zhǔn)確吸取甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.0 mL 于10 mL容量瓶中，用乙腈溶劑定容至刻度，塞緊瓶蓋搖勻后，于4 ℃冰箱避光保存。

（2）1 μg·mL-1甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。用0.1 mL 的A級刻度移液管準(zhǔn)確吸取甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL 于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，于4 ℃ 冰箱避光保存。

（3）基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。通過同樣的前處理過程處理空白陰性的黃瓜樣品獲得空白基質(zhì)液。分別將0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、0.70 mL 和1.00 mL甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)中間溶液準(zhǔn)確吸取至10 mL 容量瓶中，用空白基質(zhì)液定容，配制成0.005 ng·mL-1、 0.010 ng·mL-1、0.020 ng·mL-1、0.050 ng·mL-1、 0.070 ng·mL-1和0.100 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲拌磷質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，以甲拌磷定量離子峰面積AS為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一元線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。準(zhǔn)確稱量10 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，用10 mL刻度移液管吸取10 mL乙腈，再加入1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min后，打開蓋子加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、l g檸檬酸鈉二水合物以及0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（本次實(shí)驗(yàn)使用安捷倫成品提取鹽包），劇烈振蕩1 min后，在4200 r·min-1的條件下離心5 min。

（2）凈化。吸取6 mL上清液至內(nèi)含除水劑和凈化材料的塑料離心管中（本次實(shí)驗(yàn)使用安捷倫耗材： 900 mg無水硫酸鎂、150 mg PSA），渦旋混勻1 min。 4200 r·min-1離心5 min后，用塑料吸管吸取上清液，過有機(jī)微孔濾膜后裝入進(jìn)樣瓶中，待測定。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相A：水（含有1‰甲酸）；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。離子源類型：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；離子源溫度：500 ℃；電噴霧電壓：5500 ℃；輔助加熱氣：50 psi；霧化氣壓力：50 psi；氣簾氣壓力：35 psi；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測。甲拌磷的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立

檢測樣品中甲拌磷殘留量的計(jì)算公式為

式中：X為試樣中甲拌磷的殘留量，mg·kg-1；C為樣品中的質(zhì)量濃度，mg·L-1；V為提取液體積， mL；m為試樣質(zhì)量，g。

表2 甲拌磷的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的來源

通過前處理的全過程和數(shù)學(xué)模型來看，通過本方法測定黃瓜樣品中甲拌磷農(nóng)藥殘留的不確定度主要來自于5個(gè)方面：樣品在稱量的過程中通過萬分之一天平引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(M)；樣品在前處理的過程中因?yàn)樘崛∫阂译嫒芤旱捏w積變化而引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)；標(biāo)準(zhǔn)溶液及其配制全過程中因體積變化而引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(P)；標(biāo)準(zhǔn)曲線在儀器上擬合的過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)；加標(biāo)陽性樣品在重復(fù)測定過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure1(W)。

2.2 不確定度各分量的評定

2.2.1 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(M)

稱量時(shí)，通過天平稱取黃瓜樣品10.00 g，稱量允許誤差為±0.5 mg，按矩形分布計(jì)算，，根據(jù)不確定度的B類評定，在稱樣的時(shí)候，由樣品的稱樣量誤差引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(M)為

2.2.2 樣品在整個(gè)前處理過程中提取液體積變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)

（1）提取時(shí)加入的乙腈提取液總體積而引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vt)。

《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[10]規(guī)定，在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)室溫為20 ℃時(shí)，10 mL的A級分度吸量管分取10.0 mL乙腈允差為±0.050 mL。 據(jù)不確定度的B類評定，單標(biāo)線吸量管允差引起的體積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vt1)為

因此，在提取時(shí)加入的乙腈總體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure1(Vt)為

（2）分取6 mL乙腈時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vf)。用1支10 mL分度吸量管移取6.00 mL乙腈提取液，A級10 mL分度吸量管的容量允許誤差為±0.050 mL，則由于分取液體使用的分度吸量管允差引起的體積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vf1)為

因此，分取6 mL乙腈的體積時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure1(Vf)為

則樣品在整個(gè)前處理過程中由于乙腈提取液溶液總體積變化而引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)為

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制的過程中引入的不確定度urel(P)

標(biāo)準(zhǔn)溶液在整個(gè)配制過程中共有3個(gè)過程可引入不確定度，分別為甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C0)；由分度吸量管在吸取標(biāo)液時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(Vy)；由10 mL容量瓶在定容時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 為urel(Vr)。

（1）甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C0)。根據(jù)甲拌磷的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液的濃度C0為1000 μg·mL-1，其擴(kuò)展不確定度為0.02 μg·mL-1，，則甲拌磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定urel(C0)為

（2）甲拌磷的標(biāo)準(zhǔn)儲備液在配制過程中，通過移液管引入的不確定度urel(Vc)。實(shí)驗(yàn)使用1 mL單線標(biāo)吸量管，，據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》 （JJG 196—2006），1 mL A級單線標(biāo)吸量管的容量允許差為0.007 mL，則標(biāo)準(zhǔn)儲備液在配制過程中通過單線標(biāo)吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vc1)為

實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度在（20±5） ℃內(nèi)波動(dòng)，按照矩形分布來計(jì)算，，溶劑乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，假設(shè)溫度變化是均勻分布的，則由實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vc2)為

甲拌磷的標(biāo)準(zhǔn)儲備液在配制過程中引入的不確定度urel(Vc)為

（3）甲拌磷的標(biāo)準(zhǔn)中間液在配制過程引入的不確定度urel(Vz)。實(shí)驗(yàn)使用0.1 mL分度吸量管，，據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）， 0.1 mL A級分度標(biāo)吸量管的容量允許差為0.002 mL。 則標(biāo)準(zhǔn)中間液在配制過程中使用1次分度吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vz1)為

（4）甲拌磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線液在配制的過程引入的不確定度urel(Vq)。實(shí)驗(yàn)使用1 mL分度吸量管，分度吸量管按矩形分布計(jì)算，，據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），1 mL分度吸量管容量允許差為0.008 mL。使用4次1 mL分度吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vq1)為

實(shí)驗(yàn)使用0.1 mL分度吸量管，分度吸量管按矩形分布計(jì)算，，據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》 （JJG 196—2006），0.1 mL的A級分度標(biāo)吸量管的容量允許差為0.002 mL。使用2次0.1 mL分度吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vq3)為

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度在（20±5） ℃內(nèi)波動(dòng)，按矩形分布計(jì)算，，溶劑乙腈的膨脹系數(shù)為1.37× 10-3℃-1，則由實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vq4)為

甲拌磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線液在配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vq)為

所以在整個(gè)配制的過程中由于分度吸量管引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vy)為

（5）標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制的過程中由于使用容量瓶而引入的不確定度urel(Vr)。

在配制標(biāo)準(zhǔn)工作液的過程中由容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vr)為

則在標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(P)為

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線在擬合的過程中引入的不確定度urel(S)

本方法為外標(biāo)法定量，整個(gè)過程就是將標(biāo)準(zhǔn)曲線的每個(gè)濃度點(diǎn)連續(xù)進(jìn)樣3次，峰面積和濃度結(jié)果見表3，最終得到的線性方程為y=9625.90877x+ 158.51554 （r=0.99973，r2=0.99946）。

以擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為定量標(biāo)準(zhǔn)，對加過標(biāo)的陽性黃瓜樣品進(jìn)行了6次測定，結(jié)果如表4所示。

通過得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)際陽性樣品的濃度含量時(shí)，產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為

式中：Sy/c為工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，Sy/c=0.1；a為回歸系數(shù)，a=9625.91；p為樣品上機(jī)連續(xù)測定次數(shù)，p=6；n為所配標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)個(gè)數(shù)，n=6；m為標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定的次數(shù)，m=3；為曲線各點(diǎn)的平均質(zhì)量濃度，=42.5 μg·mL-1；

則曲線在擬合的過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)為

表4 樣品測量結(jié)果

2.2.5 樣品重復(fù)測定引入的不確定度urel(W)

本實(shí)驗(yàn)由同一名實(shí)驗(yàn)者在同一實(shí)驗(yàn)條件下，完全按照相同的上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理，實(shí)驗(yàn)過程中用到的試劑、耗材和標(biāo)準(zhǔn)品均為同一批次，在非常短的時(shí)間內(nèi)反復(fù)測定黃瓜樣品中的甲拌磷含量，在經(jīng)過6次測定之后，已滿足結(jié)果評定的重復(fù)性條件。將本次實(shí)驗(yàn)前處理過程中渦旋的速率和勻漿的速率等因素引入的不確定度分量全部合并為總的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不確定度分量，最終結(jié)果通過貝塞爾公式計(jì)算，可以得到A類評定的數(shù)值。

采用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S為

采取6次平行重復(fù)測定的數(shù)值計(jì)算其算術(shù)平均值，作為陽性黃瓜樣品中甲拌磷的含量。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(W)為

陽性黃瓜樣品通過不斷重復(fù)測定，在檢測過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(W)為

2.3 測量不確定度的評定

2.3.1 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

在檢測過程中的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)為

2.3.2 相對擴(kuò)展不確定度

95%置信水平下，取k=2，則相對擴(kuò)展不確定度uGC為

2.3.3 擴(kuò)展不確定度

2.3.4 結(jié)果表示

用QuEChERS的前處理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜中甲拌磷，結(jié)果為（0.01756±0.0035）mg·kg-1；k=2。

3 結(jié)論

綜上，影響黃瓜中的甲拌磷農(nóng)藥殘留測量結(jié)果的不確定度最大的分量為標(biāo)準(zhǔn)溶液在整個(gè)配制過程中由于使用玻璃量器和環(huán)境溫度變化而引入的不確定度，其次是樣品前處理過程引入的不確定度、樣品重復(fù)測量引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測儀器上擬合成曲線的時(shí)候引入的不確定度，最后則是樣品稱樣引入的不確定度。綜上所述，在采用國標(biāo)GB 23200.121—2021測定蔬果中的農(nóng)藥及其代謝物的殘留量時(shí)，應(yīng)當(dāng)非常嚴(yán)格地按照操作規(guī)程操作，在稱樣的時(shí)候做好天平使用記錄，并定期對天平進(jìn)行檢定；應(yīng)當(dāng)購買合格標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用的玻璃量器也必須進(jìn)行嚴(yán)格檢定；在樣品上機(jī)的過程中做好儀器使用記錄并定期對儀器進(jìn)行期間核查，確保在整個(gè)測量期間維持相對穩(wěn)定的工作狀態(tài)。另外，確保從稱樣到上機(jī)的全流程都有痕跡可復(fù)核，每個(gè)環(huán)節(jié)都要做到盡可能的精確，才能降低檢測結(jié)果的不確 定度。