氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量 的不確定度分析

謝翠美，姚婉儀，胡浩光，劉少彬，彭家杰

（東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞 523000）

酰氨醇類又稱氯霉素類抗生素，是在獸醫臨床上用于治療畜禽以及水產動物細菌性疾病的廣譜抗生素，主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考[1]。在水產品監測監管中氯霉素（Chloramphenicol，CAP)屬于禁用藥物，而氟苯尼考（Florfenicol，FFC)和甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP)屬于限用藥物。這些藥物一旦在水產品或環境中殘留，不但威脅消費者的健康，還抑制水產行業的發展[2]。

相同濃度的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考待測液，在使用液質聯用儀（AB API4000+）與液質聯用儀（Waters）檢測時很容易發現：選擇前者的負離子模式檢測時檢測信號好，其穩定性更高。為了使檢測結果更可信，計算其測定不確定度非常有必要，且在表述完整的測量結果時，應包括測量不確定度，測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性[3-4]，與測量結果相聯系的參數[5]。本文深入探討使用液質聯用儀（AB API4000+）檢測水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量的不確定度的影響因素，并對這些影響因素進行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜質譜聯用儀（AB API4000+）[7]；氮吹儀；氯霉素標準品（99.24%±0.77%）、甲砜霉素標準品（99.43%±0.5%）、氟苯尼考標準品（99.90%± 0.30%）、氯霉素-D5標準品（100.0 mg·L-1），均購于Dr.Ehrenstorfer公司；電子天平（精準至0.001 g與 0.00001g）；乙酸乙酯、正己烷、甲醇等有機試劑均是Fisher品牌；超純水（達到一級水標準）；氨水（國藥）。

1.2 方法依據及測定流程

本實驗方法依據《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 20756—2006）[6]。測定流程圖見圖1。

1.3 儀器條件

LC-MS（AB API4000+）工作參數設置為電噴霧離子源；ESI-；C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速： 0.40 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相設置比例為乙腈∶水=25∶75；出峰時間：10 min。

2 不確定度評定

2.1 建立數學模型

樣品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量的數學模型為

式中：X為使用LC-MS(AB API4000+)檢測氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的殘留量，μg·kg-1；C為回歸直線方程擬合得樣品溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考濃度，ng·mL-1；V為待測溶液的定容體積，mL；m為稱樣量，g；f—r為回收率，%。

2.2 分析確定不確定度來源

影響測量試樣中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等殘留量的因素有重復性測量，校準擬合曲線，樣品復溶時定容體積，稱樣，配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標液，配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考內標，回收率，以及LC-MS自身的校準因子。

2.3 各種不確定度分量的評定

2.3.1 重復測量時引入的標準不確定度urel(C1)

重復測量氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考引起的不確定度分量urel(C1)（不確定度A類標準），用標準偏差表示（算術平均值）。重復性引入：重復測量6次未知濃度樣品算出平均值，其標準偏差Sa及urel(C1)見表1。

圖1 測定流程

表1 測定結果與其相對標準不確定度（n=6）

2.3.2 校準擬合曲線引入的標準不確定度urel(C2)

配制一條8個點的標準系列曲線，標曲的濃度成梯度，對各個濃度點測量1次，繪制坐標軸，橫坐標為標液濃度cis，縱坐標為標液峰面積比Ais，最小二乘法擬合，可得A=a+b×c，線性系數r。詳見 表2。

表2 最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-峰面積

氯霉素的線性方程為y=1.36x-0.0119，r=0.996； 甲砜霉素的線性方程為y=0.412x-0.00786，r=0.997； 氟苯尼考的線性方程為y=0.722x-0.000825，r=0.996。

測量1次待測液（P=1），式中樣品濃度ci是峰面積比A，校準擬合曲線的標準不確定度。其中各項目標液面積比殘差的標準差為；校 準擬合曲線的斜率：b，截距：a；標準溶液平均濃 度值；配制的是8個點的梯度標液，故n=8； 各個標準濃度點只測量了1次：N=1；， 計算結果見表3。

表3 曲線校準引入的標準不確定度

2.3.3 定容體積引入的標準不確定度urel(C3)

樣品定容使用5 mL移液搶移取3 mL水溶液定容，檢定證書給出的擴展不確定度U=1.8 μL，k=2，由此得標準不確定度為。 本試驗在20 ℃進行，溫度對體積的影響可忽略。

2.3.4 樣品稱量引入標準不確定度urel(C4)

使用百分之一電子天平稱量樣品，其擴展不確定度U=0.05 g，k=2。稱5.00 g樣品引入的相對標準不確定度為。

2.3.5 配制氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標液引入的標準不確定度urel(C5)

（1）標準物質自身量值引入的標準不確定度urel(C51)。由氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的證書可查其自身量值與其擴展不確定度，則可算出標準物質量值的相對標準不確定度見表4。

表4 標準物質純度的相對標準不確定度

（2）標準物質稱量引入的標準不確定度urel(C52)。由電子天平（精準至0.00001 g）的檢定證書得知，U= 0.017 mg，k=2。稱標準品時引入的相對標準不確定度為

（3）配制標液定容時引入的標準不確定度urel(C53)。 定容需使用容量瓶（100 mL），查該容量瓶檢定證書可知U=0.05 mL，k=2。則

（4）稀釋標液，移取與定容引入的標準不確定度urel(C54)。稀釋時需用到1.00 mL移液器、100 mL容量瓶各1次，查兩者檢定證書，可計算稀釋引入的不確定度分別為

外標標準溶液在配制時引入的標準不確定度如下

氯霉素：

甲砜霉素：

氟苯尼考：

2.3.6 內標氘代標準物質引入的標準不確定度urel(C6)

（1）內標氘代標準物質（CAP-D5）純度引入的標準不確定度urel(C61)。氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素的內標：CAP-D5，其自身量值不確定度見表5。

表5 CAP-D5純度的相對標準不確定度

（2）移取CAP-D5引入的標準不確定度urel(C62)。使用1000 μL移液器移取內標物1 mL，查其校準證書可知U=1.3 μL，k=2，=0.00065。

（3）定容CAP-D5引入的標準不確定度urel(C63)。100 mL容量瓶U=0.05 mL，k=2，=0.000025。

（4）稀釋CAP-D5引入的標準不確定度urel(C64)。逐級稀釋內標儲備液，需使用2次1000 μL移液器和容積為10 mL與50 mL容量瓶各1次，稀釋引入的不確定度為

（5）加入CAP-D5引入的標準不確定度urel(C65)。加入75 μL CAP-D5工作液，需用100 μL可調移液器1次，查其校準證書可知U=0.18 μL，k=2，。

內標引入的不確定度如下

2.3.7 提取回收率引入的標準不確定度urel(C7)

按液相色譜-串聯質譜法測定氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘的含量，平行測試6次加標樣，加標量是1.00 μg·kg-1，用公式計算加標回收的相對標準不確定度，按均勻分布，，計算結果見表6。

2.3.8 LC-MS自身校準因子引入的標準不確定度urel(C8)

根據儀器校準證書，U=12%，k=2，則

2.4 評定測量值之間的相互關系

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘3個項目的測量值之間無相關性。

2.5 計算合成標準不確定度

將上述各項不確定度分量代入公式(2)，合成標準不確定度結果如表7所示。

2.6 計算擴展不確定度

取包含因子k=2（95%置信概率），其擴展不確定度用U=k×C×urel(C)表示，結果見表8。

3 結論

通過以上不確定度評定分析得知，利用負離子較穩定的AB液質聯用儀對甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考進行測量，影響其測量結果的因素是其自身的校準因子，此外回收率與工作曲線的擬合校準率也不容忽視，因此檢測人員不但要注意檢測過程的關鍵環節，也要經常對儀器進行清洗維護，確保儀器處于最優的運行狀態。

表6 樣品加標回收的不確定度

表7 合成標準不確定度

表8 不確定度評定結果