超高效液相色譜串聯質譜法快速測定貝類中 3種腹瀉性貝類毒素

許均圖，陳德斌，陳 燕，唐春玲

（廣州華鑫檢測技術有限公司，廣東廣州 510663）

腹瀉性貝類毒素（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）是由原甲藻屬和有毒赤潮藻類鰭藻屬的藻類產生的脂溶性多環醚類生物活性毒素[1]。腹瀉性貝類毒素可在貝類、魚類等動物體內富集，性質穩定。人類食用這些被污染的水產品時，會引起急性中毒，其中毒癥狀主要表現為腹瀉、嘔吐、腹痛等[2]。赤潮在我國沿岸海域均有發生，腹瀉性貝類毒素也是對我國具有最嚴重威脅的赤潮藻毒素之一，因此有必要加強貝類腹瀉性貝類毒素的監測。

目前腹瀉性貝類毒素的檢測方法主要有小白鼠法、酶聯免疫法、酶活力抑制分析法、高效液相色譜法以及高效液相色譜串聯質譜法等[3-7]，其中酶聯免疫法和酶活力抑制分析法簡單快速，但是容易出現假陽性，而且不能定性是哪一種毒素。小白鼠法需要使用大量的小白鼠，不具有特異性，且靈敏度較差。高效液相色譜法需要衍生，干擾較多，穩定性較差。高效液相色譜串聯質譜法是能高效分離和準確定性定量的新型分析方法，具有高的特異性和高靈敏度，被廣泛應用于獸殘、農殘和毒素的分析檢測。本研究通過優化檢測條件和前處理方法，建立了快速測定貝類樣品中3種腹瀉性貝素的分析方法，在8 min內完成了3種腹瀉性貝類毒素的快速分離測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯質譜（液相系統：Waters UPLC，美國Waters公司；質譜系統：TSQ Quantum， 美國賽默飛公司）；超聲波發生器（昆山市超聲儀器有限公司）；多管渦旋振蕩器（上海安譜EOAAHM-01）；氮氣吹干儀（北京八方世紀BF-2000）；高速冷凍離心機（湖南赫西HR/T20MM）；電子天平（賽多利斯BSA822-CW），HLB固相萃取柱（60 mg/ 3 mL，安譜公司）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱 （200 mg/3 mL，安捷倫公司）。

甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，MREDA公司；超純水；其他試劑均為分析純。

大田軟海綿酸（OA）8.4 μg·mL-1、鰭藻毒素 -1（DTX-1）7.8 μg·mL-1、鰭藻毒素-2（DTX-2） 3.8 μg·mL-1，均購自加拿大海洋生物科學研究所。上述標準品均用甲醇配制成1.0 μg·mL-1的儲備液，保存于-20 ℃冰箱中，用乙腈配制100 ng·mL-1的標準使用液。

1.2 樣品前處理

稱取（2.00±0.01）g制備均勻的樣品，加入10 mL 80%乙腈溶液，振蕩5 min，超聲10 min，4 ℃下 10000 r·min-1離心5 min。準確移取1 mL提取液，加入125 μL 2.5 mol·L-1NaOH溶液，置于恒溫箱中76 ℃下培育40 min，待冷卻至室溫后，加入125 μL 2.5 mol·L-1HCl溶液，所得溶液過Captiva EMR-Lipid小柱，并用1 mL 80%乙腈溶液淋洗，收集洗脫液于5 mL離心管中，混勻后過0.22 μm有機相濾膜后上機分析。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫RRHD Eclipse Plus C18（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）；流動相為5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B），流速為0.2 mL·min-1，柱溫為35℃；梯度洗脫程序：0～1 min，70% B；1～ 3 min，70%～95% B；3～6 min，95% B；6.1～ 8.0 min，10% B。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源；負離子模式；鞘氣壓力：35 aux， 輔助氣壓力：15 aux，毛細管溫度：350 ℃；噴霧電壓3500 V；SRM掃描模式；各個化合物經優化后的質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜柱和流動相的選擇

2.1.1 色譜柱

分別比較了Agilent Eclipse Plus C18（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）和Agilent SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），結果如圖1所示。發現SB-C18的峰形拖尾嚴重，這可能是因為SB-C18的填料未封端，而腹瀉性貝類毒素結構多為帶多羥基的酸性化合物，和填料上的硅羥基作用導致拖尾。而Plus C18峰形良好，因此采用Plus C18作為分析柱。

2.1.2 流動相

分別比較了不同的流動相的分離效果，如圖2所示。結果表明采用5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸溶液+乙腈作為流動相時，3種腹瀉性貝類毒素的分離度、峰形和響應最好。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

腹瀉性貝類毒素都是脂溶性的化合物，不溶于水，易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙腈等有機溶劑[8]。本研究分別比較了甲醇、乙腈、80%甲醇溶液、80%乙腈溶液作為提取溶劑時的總體回收率，結果見表2。

表1 腹瀉性貝類毒素的質譜檢測參數

圖1 不同色譜柱的色譜圖

圖2 不同流動相組成的色譜圖

表2 不同提取溶劑的總體回收率比較（單位：%）

結果表明，以80%乙腈作為提取溶劑，3種貝類毒素的總體提取效率最高。這可能是因為甲醇溶解少量脂肪帶入基質干擾，而乙腈可以沉淀蛋白質，從而降低了基質效應。

2.2.2 凈化方法的選擇

貝類樣品含有豐富的蛋白質和脂質，如果不經過凈化直接上樣分析，很容易污染離子源，同時較強的基質效應也會降低待分析物的響應，使得定量結果偏低，因此應選擇適當的凈化方式。本研究比較了HLB小柱和安捷倫Captival EMR-Lipid小柱凈化的效果，結果如圖3所示。

圖3 不凈化、EMR柱凈化和HLB凈化的加標樣品響應值比較

結果表明，HLB小柱和Captival EMR-Lipid小柱均可以起到降低基質效應，提高響應值的效果。但是HLB小柱凈化需要稀釋上樣，活化、淋洗、洗脫濃縮等步驟，前處理過程較為煩瑣，不利于大批量樣品同時處理。安捷倫Captiva EMR-Lipid小柱無需活化、能凈化樣品蛋白質、脂質等干擾物，操作簡單。過柱后用1 mL提取液淋洗可以減少吸附，提高回收率。因此，本實驗選擇安捷倫Captiva EMRLipid小柱進行凈化。

2.3 方法學確認

2.3.1 線性范圍和檢出限

用無毒素檢出的貝類樣品處理后的提取液稀釋DSP混合標準溶液，配制成濃度為0.5～20.0 ng·mL-1的基質標準溶液，上機測定。3種腹瀉性貝類毒素的線性關系良好，相關系數均大于0.99。以3倍信噪比法計算方法的檢出限，各個化合物的線性方程和檢出限如表3所示。

表3 檢出限、加標回收率和精密度實驗結果（n=6）

2.3.2 方法的回收率

采用無毒素檢出的貝類樣品，添加混合標準溶液， 添加水平為5 μg·kg-1和20 μg·kg-1進行回收率實驗，計算各個化合物的方法回收率，如表3所示。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜串聯質譜法快速測定貝類樣品中3種腹瀉性貝類毒素的分析方法。該方法操作簡單、靈敏度高、回收率和精密度較好，適合應用于貝類樣品樣品中腹瀉性貝類毒素的 監測。