TRPV4在眼科疾病中的研究進展

王 烽，賴江峰，曹玲英，邵 毅

0 引言

瞬時受體離子通道是果蠅視覺傳導研究中首次發現的一組蛋白質超家族結構，主要位于質膜上[1]。瞬時受體電位(TRP)超家族根據氨基酸同源性細分為七個亞家族：TRPC(canonical),TRPV,TRPM(melastatin),TRPN(NOMPC),TRPA(ANKTM1),TRPP(polycystin) and TRPML(mucolipin)[2]。瞬態電位受體香草醛4(TRPV4)是一種廣泛表達、多模門控、非選擇性陽離子通道，適用于鈣、鈉、鉀和鎂等離子。各種刺激因素，如適度的熱量、滲透壓、細胞腫脹、內源性和外源性化合物，都會影響TRPV4的活性。TRPV4通道能夠在無刺激的情況下被激活，并參與多種生理功能，包括滲透壓調節、Ca2+穩態、凋亡和自噬[3]。TRPV4在眼球各種組織中表達，包括角膜、晶狀體、睫狀體、小梁網和視網膜，由于其在各種生理功能中的作用，TRPV4已成為許多疾病狀態的一個有吸引力的靶點[4]。越來越多的研究發現，TRPV4通道在多種眼病中發揮調控作用，本文就TRPV4信號通道在近年來眼科疾病中的研究進展進行綜述，為眼科疾病的病理機制研究及治療提供思路。

1 TRPV4與角膜上皮損傷

角膜對溫度、機械和化學等刺激的感受依賴于各種傷害性感受器[5]。角膜上皮是覆蓋角膜的一層上皮細胞，負責保護角膜免受環境危害。淚膜滲透壓的變化會損害組織的完整性，最終導致視力障礙[6]。研究表明，角膜上皮細胞可通過激活各種離子通道來調節損傷后的角膜[6]。TRPV4是參與滲透壓的重要離子通道，而TRPV4表達僅限于角膜上皮最外層的非典型結構域，因此其功能對角膜上皮內緊密連接的形成至關重要[7]。Luka等研究了小鼠角膜上皮細胞的腫脹、溫度、應變和化學轉導機制，結果發現通過TRPV4的鈣離子流入轉導角膜上皮的滲透和熱輸入，并促進半通道依賴性ATP釋放[8]。因此TRPV4-半通道-ATP信號軸可能調節過度機械、滲透和化學刺激引起的角膜疼痛。此外，Pan等[9]使用siRNA敲除TRPV4基因時，發現角膜上皮細胞的調節容積減少(regulatory volume decrease，RVD)活性會受到抑制，這提示TRPV4在調節角膜上皮內的滲透壓方面起著重要作用。角膜的損傷會導致炎性細胞因子的釋放，從而導致纖維化。Okada等[10]使用TRPV4拮抗劑治療角膜堿燒傷的小鼠，免疫組織化學顯示，小鼠的角膜瘢痕形成和炎癥明顯減少，研究結果顯示通過阻斷TRPV4通道激活可能有助于角膜堿燒傷傷口愈合過程中發生的嚴重纖維化和炎癥反應。Okada等[11]建立了神經營養性角膜病的小鼠模型，發現敲除TRPV4基因抑制了小鼠角膜上皮修復，而將TRPV4基因插入受損的三叉神經可通過上調神經生長因子恢復角膜上皮的愈合，這說明TRPV4可能是改善嚴重損傷引起的角膜傷口愈合結果的潛在藥物靶點。上述研究表明，TRPV4通道在角膜上皮細胞感知外在壓力源及角膜損傷的愈合修復中都發揮著重要的作用(圖1)。

2 TRPV4與青光眼

青光眼是一種不可逆的致盲性眼病，由眼壓間歇性或持續性升高導致視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGC)凋亡，視神經萎縮，最終導致視野缺損[12]。眼壓的形成與房水循環密切相關，房水動力學異常，會引起病理性眼壓升高[13]。研究證實，TRPV4通道在調節眼壓功能方面具有關鍵作用，TRPV4通道在睫狀體非色素睫狀上皮(non-pigment epithelium，NPE)中選擇性表達，負責感知滲透性改變和分泌房水，因此這對于滋養眼睛的無血管結構和將眼壓維持在生理值范圍內非常重要[14]。Andrew等發現小鼠NPE細胞腫脹產生的低滲效應可以直接觸發TRPV4介導的Ca2+向內流動，TRPV4通道可以被PLA2途徑釋放的花生四烯酸(arachidonic acid，AA)間接激活，最終導致房水的大量產生，這結果可能為房水分泌和眼壓調節的機制提供新的見解[14]。Hanan等探討了TRPV4激動劑GSK1016790A在人類非色素睫狀上皮細胞衍生的細胞系中調節褪黑激素產生的作用，結果發現TRPV激動劑可導致人NPE細胞中褪黑激素的細胞外水平呈濃度依賴性增加[15]。而褪黑激素可以通過該組織中存在的褪黑激素受體，減少睫狀上皮產生氯化物的增加來降低眼壓[16]。青光眼的標志是RGC的死亡，免疫化學表明，大量的TRPV4位于RGC中的視神經乳頭和軸突的神經纖維層。研究發現，TRPV4激動劑會增加RGC的放電率，導致Ca2+流入，這些通道的持續激活會導致RGC死亡[17]。Taylor等[18]通過免疫組織化學標記物以及形態學染色評估TRPV4活性，對視網膜變性體外模型中神經元和神經膠質激活的調節作用，研究結果發現抑制視網膜內的TRPV4顯著提高了神經節細胞的存活率，改善了視網膜層狀結構的維持并減弱了膠質細胞反應，這表明抑制TRPV4可用作青光眼的潛在治療方法。此外，研究發現TRPV4通道與小梁網(trabecular meshwork，TM)內的機械傳導有關，其中TM細胞的拉伸或通過TRPV4激動劑的激活會導致Ca2+內流、黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的磷酸化、紐蛋白的重組和應力纖維的重塑[16]，這些都對維持眼壓至關重要。Ryskamp等[19]應用生化和功能分析將TRPV4定位到原代人類TM(hTM)細胞的質膜，結果發現，當鈣離子升高時，TRPV4激活會導致小梁網細胞中的應力纖維和黏著重塑，而GSK1處理的3D小梁網模型會增加F-肌動蛋白應力纖維的形成和纖維連接蛋白的表達，TRPV4拮抗劑可以減弱這些影響，并且發現眼內注射TRPV4拮抗劑可降低青光眼小鼠眼睛的眼壓，并保護視網膜神經元免受眼壓誘導的死亡。因此，上述研究表明TRPV4是傳統流出通路中潛在的眼壓傳感器，同時也是治療青光眼降低眼壓和保護神經節細胞免受損傷的新靶點(圖2)。

圖1 TRPV4通道在角膜上皮的維持和修復中的激活機制 低張力誘導的機械應力激活TRPV4通道，通過調節體積減少(RVD)使細胞體積正常化。角膜上皮中TRPV4的激活導致Ca2+內流，導致跨上皮阻力增加，這是緊密連接組裝所需的，也與神經生長因子的釋放和角膜上皮細胞的增殖有關。

圖2 TRPV4通道在睫狀體/小梁網中的激活機制及作用 滲透性細胞膨脹拉伸質膜并激活PLA2酶，PLA2酶將磷脂分解為花生四烯酸(AA)及其代謝產物EET。EET激活TRPV4通道，導致Ca2+內流和隨后的信號級聯。TRPV4介導的鈣流入依賴的FAK磷酸化誘導連接蛋白重組和應力纖維重塑，這與眼壓(IOP)的升高有關。TRPV4介導的Ca2+內流激活AQP4也有助于眼壓的維持。此外，TRPV4的激活涉及N-乙酰基轉移酶(AANAP-P)的磷酸化，導致褪黑激素的產生。

3 TRPV4與年齡相關性白內障

白內障是透明晶狀體內部的混濁，會改變晶狀體的透明度和折射率，從而導致嚴重的視力障礙[20]。晶狀體的透明度和折射特性由內部微循環系統提供的細胞生理學維持，老化對晶狀體運輸、離子降解和水分穩態產生負面影響，并導致晶狀體水分含量的變化。這會改變晶狀體的性質，導致光學質量和調節幅度的變化，最初會導致中年老視，最終表現為年齡相關性白內障[21]。研究表明，TRPV1和TRPV4是晶狀體中重要的滲透壓調節劑，通過調節鈉轉運活性來響應靜水壓力的變化[22]。TRPV4表達最初被認為定位于晶狀體的上皮細胞中[23]，然而Nakazawa等[24]對晶狀體冷凍切片進行免疫標記，證實了TRPV4在晶狀體的所有區域都有表達。Chen等[25]測試了牛晶狀體中的壓力反饋調節機制以及是否會調節整體晶狀體的光學特性，研究結果表明，TRPV4介導的晶狀體靜水壓力反饋控制可以確保晶狀體水傳輸的任何波動，以及因此產生的水分含量，不會導致晶狀體功率的變化，從而導致整體視覺質量的變化。因此，研究表明TRPV4是維持晶狀體內穩態所必需的。Nakazawa[26]研究了白內障形成有效的關鍵化合物，發現由Na+/K+-ATP酶控制的晶狀體靜水壓力的相關變化有助于延緩白內障的發展。在晶狀體中，Na+/K+-ATP酶已被證明受TRPV4調節，如果晶狀體中負壓持續存在，那么Na+/K+-ATP酶活性會降低，相反，TRPV4檢測晶狀體中的正壓并引導依賴P2Y/SFK的級聯反應，導致Na+/K+-ATP酶活性增加，從而鈉從上皮細胞中運輸出來，以恢復壓力，而滲透壓的變化對晶狀體微循環極大影響。因此上述研究提示TRPV4在白內障的發展中發揮重要作用，可以作為預防和延緩白內障的新靶點(圖3)。

圖3 晶狀體TRPV4通道對離子和水穩態的調節機制 TRPV4在滲透壓或晶狀體上皮損傷時被激活，TRPV4介導的鈣內流通過連接蛋白和泛素連接蛋白半通道誘導ATP釋放。然后ATP結合嘌呤能受體并誘導Src依賴性Na+/K+-ATP酶激活，恢復晶狀體中的壓力和離子穩態。

4 TRPV4與視網膜疾病

4.1TRPV4與糖尿病視網膜病變糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種威脅視力的糖尿病并發癥，也是導致視力喪失的主要原因[27]。糖尿病視網膜病變的主要發病機制不僅涉及視網膜血管的結構改變，還涉及血管周圍神經元或神經膠質組織的功能障礙[28]。使用連續固定焦點視網膜電圖，RGC和雙極細胞在早期糖尿病視網膜病變中表現出異常活動。此外，RGC和Müller細胞(一種視網膜神經膠質細胞)顯示凋亡增加[29]。TRPV4在小鼠的RGC、Müller細胞和視神經頭中表達[30-31]。TRPV4在視網膜內充當代謝、滲透、機械和炎癥信號的哨兵，并參與調節一系列病理生理功能，如RGC和光感受器的喪失、Müller細胞的肥大和病理性腫脹，以及BRB的維持。Lakk等[30]研究發現，TRPV4可以在Müller細胞中介導膽固醇依賴性多模式轉導。此外，高膽固醇血癥視網膜表現出類似的病理學，包括反應性膠質增生、視網膜微血管內皮屏障通透性升高、RGC變性和病理性膠質腫脹，以及TRPV4過度激活。Ryskamp等[17]的研究表明，RGC中TRPV4的激活介導了對膜拉伸的反應，導致細胞內Ca2+水平升高，興奮性增強。持續暴露于TRPV4激動劑會導致過度的Ca2+內流，這可能會激活Ca2+依賴性促凋亡信號通路，并在RGC中誘導時間和劑量依賴性凋亡。而DR的主要特征之一是血-視網膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)的破壞，從而導致血管源性水腫和神經組織損傷。Kevin等通過定量PCR和免疫染色證明TRPV4在培養的牛視網膜微血管內皮細胞中的功能性表達，并且通道表達和活性都被高血糖下調，研究結果表明TRPV4功能的喪失可能導致糖尿病中的內皮功能障礙[32]。Arredondo Zamarripa等[33]評估了玻璃體內注射TRPV4拮抗劑在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠視網膜BRB分解的結果，發現TRPV4拮抗劑可將BRB分解緩解至與血管抑制素相似的水平，結果表明TRPV4拮抗劑和血管抑制素通過激活互補途徑協同作用，抵消了對RPE通透性的影響。Ordua等[34]評估了TRPV4抑制劑是否可消除鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的視網膜水腫，結果顯示TRPV4基因敲除小鼠中的視網膜變薄，這表明TRPV4的缺失可消除視網膜水腫，有助于控制糖尿病視網膜病變中BRB分解和水擴散增加的發展。總之，這些研究強調TRPV4是治療糖尿病視網膜病變的潛在靶點。

4.2TRPV4與視網膜脫離視網膜脫離(retinal detachment，RD)可導致感光細胞死亡，從而導致視力下降，其中神經元和神經膠質的病理性腫脹是RD的一個重要特征[35]。Müller細胞是貫穿視網膜全層的主要神經膠質細胞,Müller細胞的神經源潛能可通過其靶向特異性激活相應信號通路,啟動膠質反應去分化為神經元[36]。Matsumoto等[37]建立了急性RD小鼠模型以研究RD引發的感光細胞死亡的分子機制，研究結果發現敲除了TRPV4的小鼠中視網膜凋亡光感受器的數量相較于野生型小鼠減少了約50%。研究顯示在Müller膠質細胞中表達的TRPV4可以被RD誘導的這些細胞腫脹引起的機械刺激激活，導致細胞因子MCP-1的釋放，據報道它是Müller膠質細胞衍生的介質RD誘導的光感受器死亡的強介質。并且體溫的升高可以顯著提高TRPV4通道的敏感性。因此，敲除TRPV4可以抑制RD病理條件下的細胞死亡，并表明Müller神經膠質細胞中的TRPV4可能是防止RD后感光細胞死亡的新治療靶點。

4.3TRPV4與早產兒視網膜病變早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是兒童失明的最常見原因之一，它是一種分兩個階段發生的血管增生性疾病。首先，早產使嬰兒處于相對高氧的環境中。高氧會減少視網膜中包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在內的生長因子的產生，從而導致血管成熟延遲。其次，隨著視網膜的成熟，增加的代謝活動使現有血管的氧合供應不足，導致視網膜缺血。這反過來導致VEGF的產生增加，從而導致異常的新生血管增殖[38]。O’Leary等[39]研究了TRPV4通道對視網膜血管生成的作用，發現在早產兒視網膜病變的小鼠氧誘導缺血性視網膜病變(oxygen-induced ischemic retinopathy，OIR)模型中，通過玻璃體內注射TRPV4抑制劑可抑制早產兒視網膜病變小鼠模型中缺血驅動的新生血管形成，同時增強缺血視網膜內的血管恢復。這可能為早產兒視網膜病變的治療干預提供新的靶點(圖4)。

圖4 TRPV4通道調節視網膜血管生成機制 TRPV4保持內皮細胞中Rho/Rho激酶活性在最佳水平，從而導致生理(最佳)血管生成。然而，TRPV4的減少或缺失導致機械感應異常，增強Rho/Rho激酶活化，導致血管生成異常，這可能導致視網膜病變。TRPV4在視網膜內皮細胞中與TRPV1通道形成異聚體通道，抑制這兩種通道可以抑制OIR誘導的異常血管生成。

5 總結和展望

綜上所述，研究證明TRPV4通道在維持正常的眼部生理機能和在眼部疾病發生發展中都發揮了非常重要的作用，TRPV4是組成型表達并且能夠在無刺激的情況下自發激活，這與它通過調節細胞Ca2+水平以及細胞內水平衡來參與控制穩態功能有關。TRPV4在眼球不同的細胞類型中表達，這表明它在正常生理條件下具有多種活性。例如，TRPV4可檢測眼壓、剪切應力的變化，并維持眼內的滲透壓。基于其在眼部病變中的作用，TRPV4功能障礙是與這些疾病狀態相關的表型變化的部分原因。但是由于目前對TRPV4通道在眼部結構中表達的定位以及具體機制還不是完全清楚，特別需要在視網膜病變和青光眼中的作用進行更多研究，TRPV4應被視為治療眼部疾病的潛在靶點，相關的TRPV4抑制劑的開發也在相關眼病的治療過程中顯示出巨大的潛力，并為治療眼病提供更多的幫助。