一個中國原發性開角型青光眼家系致病基因研究

頡娟娟，陳 穎，張國偉，崔海悅，郝夢瑤，王劭雯，賈 珍，徐春龍，陸 宏

0 引言

青光眼是一種以進行性的視覺損害為特征的慢性退行性疾病，是全世界排名第二的主要致盲性眼病。全球40～80歲人群青光眼患病率為3.54%，據估計，到2040年，全球青光眼患者數量將增加到1.118億人[1]。原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)是最常見的青光眼類型，約占所有青光眼病例的(74%)，可導致視力損害甚至失明[2]，在歐洲和非洲后裔中尤其常見。近年來，我國青光眼的發病率隨著近視和代謝性疾病的增加而有所增長[3]。POAG發病隱匿，患者早期通常無明顯癥狀，待到患者覺察到視力下降或者視野缺損來就診時病情往往已至中晚期。年齡、近視、高眼壓、角膜厚度、陽性家族史、代謝性疾病是POAG的危險因素[4]。陽性家族史是青光眼最重要的危險因素之一，研究結果顯示，與青光眼患者具有一級親屬關系的人，相對于普通人群，發展為青光眼的風險提高了9.4倍[5]。識別POAG致病基因及突變位點、篩查具有陽性家族史的高危人群，對青光眼的早期預防和治療有重要意義。在本研究中，我們通過對江蘇省南通市一個POAG家族進行基因檢測，并對候選致病基因LTBP2基因在POAG致病作用進行了驗證及討論。

1 對象和方法

1.1對象于2020-01/12在臨床工作中回顧并招募了一個江蘇省南通市的POAG家系(圖1)，追蹤到5代共26名，參與本研究者13名，由南通大學附屬醫院眼科青光眼專科醫師對所有參與研究家系成員進行表型評估。POAG的診斷標準為：(1)患者的房角開放，具有正常外觀；(2)兩眼中至少一眼眼壓持續>22mmHg；(3)有視神經損傷、視野缺損等青光眼特征性表現。排除繼發性青光眼；單純眼壓升高者診斷為高眼壓癥(ocular hypertension, OHT)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》和《人類遺傳疾病樣本采集指南》的原則。本研究已通過我院倫理委員會審批通過。所有參與者或其監護人均知情同意。

1.2方法對參與者進行全面的眼科檢查，包括視力、裂隙燈、眼壓、眼底檢查、視野檢查、視覺電生理檢查、光學相干斷層掃描(optical coherence tomography, OCT)和角膜厚度。

基因檢測及分析：采集所有參與研究家系成員的外周靜脈血并提取基因組DNA。對已知青光眼相關致病基因進行靶向捕獲測序，排除已報道的致病基因和突變。根據家系遺傳圖譜，選取7名家庭成員基因組DNA進行全外顯子測序，以上測序工作由邁基諾公司完成。平均測序深度不小于200X，覆蓋率不低于99.7%，排除低質量測序數據后，測序數據由Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)與hg19進行比對。使用GATK和SOAPSNP軟件查找數據中包含的Indel變異和單核苷酸多態性(SNPs)，使用CCDS、人類基因組數據庫(NCBI)、dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)、ESP6500 (https://esp.gs.washington.edu/dru)、1000Genome (ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)、ExAC_ALL (http://exac.broadinstitute.org/)和蛋白質功能預測軟件包括Ployphen_2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/) 、GERP++(https://www.Biostars.org/p/207518/)and SIFT (http://sift.bii.a-star.edu.sg/)對SNP和Indel進行注釋。經過變異分析，然后根據數據庫(1000Genome、ESP6500、ExAC ALL)排除最小等位基因頻率(MAF)大于0.02的變異。同義突變、含內含子、UTR區域的變異體也被排除。經過篩選后，將獲得的候選突變進行Sanger測序，以確定候選突變與疾病的致病關系。

2 結果

2.1臨床特征該家系診斷為POAG患者的年齡27～58(平均33.8±12.2)歲，最高記錄眼壓雙眼均為46±5.8mmHg，見表1。先證者(Ⅳ-4)是一名35歲女性，27歲時發病。雙眼視力OD:0.3, OS:0.15，矯正后無明顯提高。眼底檢查見雙眼視盤蒼白，杯盤比(C/D)0.8，雙眼視野不同程度受損。另外4名受影響的成員也出現了典型青光眼表現，其中3名患者接受了抗青光眼手術，其中患者Ⅲ-3因術后眼壓控制不理想，并出現了視網膜中央靜脈阻塞和新生血管性青光眼，曾行多次手術治療。另外兩名受影響者Ⅳ-5和Ⅳ-2均需藥物來控制眼壓。家系成員的眼底和視野特征見圖2。

表1 POAG家系成員臨床特征

2.2系譜分析該POAG家系共跨越5代人(圖1)，參與本研究者13名，有4名成員被診斷為POAG，1名診斷為OHT。其余8名無明顯青光眼表現，但其中5名年齡較小(8～14歲)。所有參與者均接受了DNA檢測。根據該家系的遺傳特征，發現該POAG家系遺傳方式符合常染色體顯性遺傳。

圖1 POAG家系系譜圖。

2.3基因檢測及分析經過靶向捕獲測序對已知青光眼致病基因進行篩選，未發現符合要求的基因突變位點。全外顯子測序篩選出了與青光眼致病可能相關的基因共18個，見表2，經基因篩選排除另外17個基因后，確定了1個可疑雜合突變LTBP2(c.1197C>A)，該突變位于14號染色體。設計引物對LTBP2基因進行聚合酶鏈式反應進行驗證。發現該基因與POAG家系并不共分離，見表3。在未受影響的家庭成員Ⅲ-7、Ⅴ-2基因組中檢測到了LTBP2(c.1197C>A)突變，而POAG患者中只有先證者(Ⅳ-4)和先證者父親(Ⅲ-3)的基因組中存在LTBP2的突變(圖3)。由此可見，該突變位點基因并不是該POAG家系的致病基因。需要進一步進行全基因組測序來確定該POAG家系致病基因。

表2 全外顯子測序結果

表3 家系成員攜帶突變情況

圖2 家系患者眼部特征。

圖3 Sanger測序結果。

3 討論

在本研究中，我們通過靶向捕獲測序和全外顯子測序在一個中國POAG家族中發現了位于LTBP2基因上一個錯義突變，該突變使基因第1197號位置上的胞嘧啶由腺嘌呤頂替，導致第399號密碼子所翻譯的氨基酸由苯丙氨酸轉為亮氨酸。迄今為止，沒有相關研究報道該突變在中國人群POAG中的致病作用。本研究中，我們采用Sanger測序驗證了LTBP2基因在POAG家系中的致病作用。結果提示，LTBP2基因突變與該家族POAG的致病無關。

潛在轉化生長因子β結合蛋白(LTBPs)是一組多結構域蛋白超家族，在結構和功能上有獨特的生物學特性。作為LTBPs家族的成員之一，LTBP2(OMIM 231300)是一個具有36個外顯子的大基因，編碼一個含有1821個氨基酸的基質蛋白-轉化生長因子TGF-β結合蛋白2(TGF-β2)[6]。LTBPs基因結構與纖維蛋白(FBN)結構相似，主要由兩種結構域(表皮生長因子樣結構域和包含8個半胱氨酸重復序列的結構域)組成。與FBN蛋白相比，LTBP基因組結構更短，在幾個序列區域沒有二硫鍵，也與已知區域沒有同源性，這使得LTBP蛋白結構更具靈活性[7-8]。TGF-β以潛在復合物的形式存在于含有原纖維的微纖維中，而LTBPs可以結合TGF-β潛在蛋白，并影響TGF-β的活性[9]。LTBPs包含的四種異構體中，LTBP2是唯一不與TGF-βs形成復合物的亞型[10]。因此,LTBP2具有獨立于潛在TGF-β的儲存和激活的功能。盡管如此，但并沒有排除LTBP2與TGF-β的非共價相互作用[11]。LTBP2在彈性組織中表達較多，如肺、心臟、骨骼肌等，在包括小梁網和睫狀體在內的各種眼組織中也均有表達而且表達較高，在角膜基質、鞏膜和虹膜中表達少量[12]。

LTBP2基因調節TGF-β信號轉導的過程可能與青光眼的發病有關。以往研究表明，青光眼患者的房水中TGF-β含量增加[13]，而LTBP2可以影響TGF-β細胞因子的活性。另有研究指出，LTBP2通過與LTBP1競爭含有微原纖維的原纖維蛋白上的結合位點而間接影響TGF-β的活性[14]。同時，LTBP2作為一種基質蛋白，還可以影響細胞外基質蛋白(extracellular matrix protein, ECM)的結構[15]，顯微鏡下檢測LTBP2突變陽性的POAG患者的成纖維細胞發現ECM的結構被明顯破壞[16]，而小梁網ECM缺陷會影響房水流出通道，從而引起眼壓升高。Suri等[11]研究中指出，LTBP2基因的敲降會影響TGF-β和BMP信號通路，還會影響ECM編碼基因的表達和細胞凋亡。

2009年，LTBP2基因首次在巴基斯坦人群中被確定為原發性先天性青光眼(primary congenital glaucoma, PCG)的致病基因[12]，開啟了LTBP2基因在青光眼中致病中作用的研究歷程。此后，LTBP2基因缺陷在伊朗人、斯洛伐克母人、印度人以及美國人中陸續被報道與PCG的發病相關[17-20]，是迄今為止已知的引起PCG發病的第二個基因，然而LTBP2突變引起PCG發病的確切機制尚不明確。有趣的是，在一項對CYP1B1陰性的散發PCG患者LTBP2基因篩查的研究中指出，LTBP2基因并不是漢族人PCG的致病基因[21]。LTBP2基因對繼發性青光眼，如小球型晶狀體和(或)巨角膜、晶狀體異位伴/不伴青光眼和Weill-Marchesani綜合征3型等也具有致病性[22-24]，這些疾病均以常染色體顯性遺傳的模式影響后代。在對本研究家系成員臨床信息收集的過程中我們發現，該家系家庭成員普遍存在身材矮小的特征，成年男性最高身高為168cm, 成年女性最高身高150cm，這與Weill-Marchesani綜合征3型結締組織疾病的癥狀有重合。在對該家族成員臨床表型、遺傳方式及LTBP2基因作用進一步研究分析后，我們否定了該家族繼發性青光眼的可能。LTBP2基因在PACG、PEX及POAG中致病作用的研究再次為我們認識LTBP2基因提供了線索[16, 25]，不同于以往LTBP2在青少年型開角型青光眼(juvenile open angle glaucoma, JOAG)[26]、原發性開角型青光眼3D型[27]家族中的遺傳模式，POAG和PEX不被視為隱性遺傳性疾病。通過對90例無關的POAG和PEX患者DNA進行LTBP2外顯子測序，在5例POAG患者和2例PEX患者的基因組中檢測到了LTBP2突變。且1例POAG患者的姐妹基因中也證實了LTBP2(p.Arg495Gln)突變，她們的父親和祖父在生前均患有青光眼，母親的基因型正常[16]。由此，LTBP2基因在POAG中的致病作用得到驗證。然而，在本研究中，LTBP2 (c.1197C>A，p.Phe399Leu)位點證實并不是該POAG家族的致病基因。盡管如此，我們并不能否認LTBP2突變在POAG散發病例中的致病作用，也不能排除未來的觀察將支持特定的基因型-表型相關性。

基因檢測技術為遺傳性疾病的基因診斷及治療提供了可能的方法。作為一種先進的基因測序技術，全外顯子組測序(whole-exome sequencing，WES)成為了遺傳性疾病的主要診斷方法，具有短周期、低成本、高效率的特點，結合Sanger測序可以提高青光眼等遺傳性眼病的診斷率，從而為陽性家族史的家庭提供生育指導。然而，人體中的基因組是一個復雜的網絡系統，全外顯子測序盡管為遺傳性疾病的診斷及研究帶來重大突破，但是只能檢測到全基因組1%的序列，存在測序片段短、準確率低、測序數據量大的不足[28]。因此，在遺傳性疾病的研究過程中，需要結合各種技術從基因轉錄組學、蛋白組學等多個層面分析遺傳性疾病的致病機制。

POAG作為一種眼部常見的致盲性疾病，其發病隱匿，盡管目前已經檢測到與青光眼致病相關的諸多基因及突變位點，POAG的致病基金研究仍是值得重點關注。LTBP2基因在POAG中作用的現象提示我們，對POAG患者LTBP2基因和其他相關ECM蛋白編碼基因突變的篩選，對探索青光眼的發病機制具有現實的意義。