基于葉綠素熒光成像的玉米苗期葉片光合特性垂直分布

肖天璞，楊 麗，張東興，王糧局，張天亮，杜兆輝，李鴻盛，夏徐隆

基于葉綠素熒光成像的玉米苗期葉片光合特性垂直分布

肖天璞，楊 麗，張東興，王糧局※，張天亮，杜兆輝，李鴻盛，夏徐隆

（1. 中國農業大學工學院，北京 100083；2. 農業農村部土壤-機器-植物系統技術重點實驗室，北京 100083）

作物的綜合光合作用能力直接決定糧食產量，探明作物光合特性分布機制是開發新品種、研發新農藝的一個關鍵科學問題。為探究玉米植株光合特性的垂直分布規律，該研究利用熒光成像技術對不同品種和不同氮、水處理的5葉期樣本進行圖像采集，對植株不同葉片的熒光淬滅特性及熒光參數進行分析。熒光淬滅特性分析表明，葉片光量子產量隨垂直高度的增加呈上升趨勢；由非加權組平均法聚類產生的四類淬滅特性中，鄭單958在不同環境中的熒光淬滅垂直分布異質性小于先玉335和浚單20。關鍵熒光參數分析結果表明，葉片最大光能轉換效率、實際光能轉換效率、光反應電子傳遞活性隨垂直高度的增加呈上升趨勢，除衰老葉片外的非光化學能量耗散差異性不顯著。光合特性垂直分布分析表明，不同土壤氮含量下樣本的最大光量子效率（Fv/Fm）有較為顯著的二次函數分布特征，隨著土壤氮含量的降低，垂直分布的異質性增大；不同品種間的穩態光適應光化學淬滅（qL_Lss）有較為顯著的一次函數分布特征，鄭單958表現出較強的抗逆性。基于機器學習方法，以熒光參數垂直分布數據分類植株組別的結果表明，鄭單958樣本的最大光量子效率（Fv/Fm）、微量土壤氮含量下樣本的最大光量子效率（Fv/Fm）和干旱環境下樣本的穩態非光化熒光淬滅（NPQ_Lss）判別準確率分別達0.82、0.94和0.88，與其他處理及熒光參數相比，垂直分布規律更顯著；其他熒光參數的分布特征并不能有效判別樣本組別。將葉片按植株形態學自下而上排序，由植株葉片光合垂直異質性關鍵葉片分析，第2片葉片可以作為垂直分布的“特征葉片”評估玉米品種和土壤氮含量，第1片葉片可以作為垂直分布的“特征葉片”評估植株土壤水含量。

葉綠素熒光；光合作用；玉米；垂直分布

0 引 言

光合作用貫穿植物生長發育的整個過程，是植物生長發育的基礎[1]。作為一種高光效的C4植物，玉米的光合作用特性對其生物量的積累影響更為顯著，直接決定了玉米的產量[2]。目前工程領域的植株光合特性研究以葉片光合關聯性分析和脅迫分析為主，研究光合作用與葉片成分含量之間的關聯[3-4]，或通過分析生物脅迫[5-6]或非生物脅迫[7-9]下的葉片光合特性，實現逆境下植物生長狀態的快速獲取。然而，植物體是一個具有復雜生理環境的整體，單一的葉片光合特征測量具有隨機性與片面性，不能精準全面地表征整個植株的生長狀態，難以探明復雜植物體的光合作用機制，而目前葉片光合作用在整個植株上的研究相對較少。

目前植物整株光合作用的相關研究主要分為兩種，一是研究葉片特征的垂直分布規律，另一種是垂直分布特性對光合作用影響的研究。Moulin等[10]研究了玉米植株垂直高度上葉面積、葉綠素含量的變化，并利用反射光譜對葉綠素含量進行分層評估；Fan等[11]通過測量玉米葉面積的垂直分布，開發了一種更適用于現代玉米生長的葉面積垂直分布方程；Lindquist等[12]通過測量與光合作用競爭密切相關的葉面積指數，研究其垂直分布規律，分析不同玉米品種的耐密機制；Li等[13]通過研究不同水分條件下玉米葉片葉綠素和氮含量的垂直分布二次曲線規律，驗證玉米葉片光合特性與水分含量的顯著相關性。以上研究內容多采用破壞性的測量方法或分層單點測量方法，這些方法通常測量復雜，易受到環境因素的影響。

隨著高通量表型檢測技術的發展，光譜技術、高光譜成像技術也越來越多地應用到光合作用分析中。相關研究表明高光譜成像可作為一種有效的技術手段，實現作物冠層對葉片特征垂直分布的預測。Wu等[14]采用多角度高光譜裝置對小麥進行遙感，并評估了小麥冠層葉綠素含量的垂直分布；He等[15]基于高光譜遙感建立了水稻葉片氮含量的垂直分布預測模型。但基于光譜反射率反演葉片垂直分布特征的準確率通常不夠穩定，易受到外界反射信號的影響，并且不能夠很好地表達和監測植株的生理狀態[16]。葉綠素熒光成像技術是目前國際最流行的光合作用檢測技術之一，具有高通量、無損傷的優點，并已成為作物育種中表型檢測的基本工具之一。同時，葉綠素熒光還可闡明損傷機理和調節機制，在光合作用、植物脅迫的研究上得到了廣泛應用。張佳菲等[17]通過快速葉綠素熒光技術，探究出不同氮素處理水平下油菜苗期冠層內生化參數及光合性能的垂直分布變化特性；Feng等[18]利用冬小麥上層葉片葉綠素熒光參數評估了植株氮素狀況。目前，葉綠素熒光技術在整個植株水平的光合作用分布研究較少，多為單點測量熒光參數在垂直方向上的分布，不能全面獲得葉片表型數據，而在整個植株水平上以葉綠素熒光成像為方法對葉片光合作用特性的研究卻鮮有報道。

本研究設計了一組析因試驗，以3個典型玉米雜交品種的不同土壤氮元素、水分處理的玉米5葉期（V5）植株為研究對象，采用葉綠素熒光成像的方法，無損高通量成像整株熒光狀況，通過對植株不同葉片的熒光淬滅特性及熒光參數進行分析，研究玉米植株葉片的光合特性垂直分布，以期為探明植株內光合特性分布機制提供一種研究方法和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料準備

育苗時間為2021年11月，地點為中國農業大學水利與土木工程學院日光溫室（東經116°21′，北緯40°）。選取市場上廣泛被應用的3個玉米品種：鄭單958（ZD958）、先玉335（XY335）、浚單20（JD20）。

試驗前期在植物工廠內放置育苗盤進行育苗催芽（溫度25℃），兩葉期選取長勢良好且相近的、與試驗需求同樣數量的玉米苗移栽至溫室（溫度20～25℃，濕度50%），考慮到冬季光照時間較短，每天17:00—19:00補光2 h，補光燈光照通量約500mol/(m2·s)。栽培介質選擇草炭、珍珠巖、椰糠按質量比2∶1∶1配比混合的土壤基質[19]，育苗前肥料作基肥施加至土壤基質。育苗盆使用內徑16 cm的圓柱形育苗盆，每盆裝土壤基質體積3 L，質量約1 kg。

根據玉米盆栽種植的肥量需求，盆栽施肥量一般為田間施肥量的2～3倍[20]，考慮到土壤基質質量較輕，按比例調高施肥量。正常施肥量為純氮0.75 g/kg土、P2O50.50 g/kg土、鉀K2O 0.60 g/kg土，即每個盆載的正常施肥量為過磷酸鈣3.12 g、氯化鉀1.00 g；尿素1.63 g。試驗中，設置微量氮肥（N0）、少量氮肥（N1）、正常氮肥（N2）3個梯度。每盆施加尿素分別為0、66%、100%正常量，即每盆施加氮肥的質量分別為0、1.09、1.63 g。試驗采用鄭單958（ZD958）、先玉335（XY335）、浚單20（JD20）3個玉米品種，微量氮肥（N0）、少量氮肥（N1）、正常氮肥（N2）3個施肥量進行全因素試驗，進行6組重復，共計54盆，具體試驗設計見表1。玉米溫室生長期間，每7 d灌水200 mL，并進行位置隨機化排布。數據采集時間為玉米植株5葉期，數據采集的前一周，只對6組重復中的3組（尾號1～3）進行灌水處理（W），其他3組進行干旱脅迫（D）。

表1 不同品種與施肥水平下玉米種植試驗設計

1.2 數據采集

本試驗所采用的葉綠素熒光成像系統為FluorCam大型葉綠素熒光成像平臺（FC800-D/8080，Photon Systems Instruments，Czech Republic）。熒光成像平臺使用帶有定焦鏡頭的CCD相機，分辨率為720×560像素，幀率為50幀/s。光源由5組發光二極管組成，包括測量光（620 nm紅光）、紅外光（735 nm）、光化光Actinic1（620 nm紅光）、光化光Actinic2（冷白光）、飽和光（冷白光）5種光源，可實現最大光量子效率測量和葉綠素熒光淬滅分析。其中，本試驗中使用的光源有測量光、光化光Actinic2和飽和光源。圖像采集系統組成如圖1所示。

1.支架 2.成像系統主機 3.光源 4.高度調節滑道 5.主電源開關 6.CCD相機 7.網線 8.樣本 9.泡沫板 10.計算機 11.圖像采集軟件

圖像采集全程在黑暗狀態條件下進行，成像空間內無風，避免葉片晃動；試驗前將待測植株在日光下充分光照20 min，光照強度350～400mol/(m2·s)，之后充分暗適應30 min，以獲得最佳熒光狀態。植株橫向放置于圖像采集區，位置位于成像平臺的正中央，使用泡沫板固定位置以確保成像穩定性；通過高度調節滑道進行成像高度控制，成像平面距離鏡頭60 cm，保證每株成像面積不超過相機成像窗口面積的2/3；植株葉片的位置在鏡頭下的成像互不干擾且盡可能保持水平，確保成像的清晰有效。首先以5%的梯度進行10組預試驗成像，結果表明在最大飽和光強的30%（1 346.0mol/(m2·s)）及以上的脈沖作用下，樣本最大光量子效率Fv/Fm穩定在0.78左右，已達到飽和點[21]，由此確定正式試驗的飽和光強為30%。由玉米實際生長環境下的光照[22]確定光化光（Actinic2）的強度為其最大光強的70%（382.9mol/(m2·s))。葉綠素熒光成像的正式試驗采用淬滅分析（Quenching Analysis）[23]，試驗進行之前，將植株重新進行20 min暗適應，按隨機順序分別對每盆植株進行成像試驗，單次成像一盆植株。淬滅分析中，第一次暗適應階段初始熒光Fo的持續時間5 s，飽和脈沖持續時間0.96 s，最大熒光Fm測量后的暫停時間為15 s；光適應階段光化光的作用時間為70 s，脈沖數量6次，脈沖持續時間0.96 s，脈沖間隔分別為9、9、9、19、19 s；第二次暗適應階段中脈沖數量為3次，脈沖持續時間0.96 s，脈沖間隔29 s。本試驗中激發光作用時間點、作用環境及熒光淬滅動力學曲線示意圖如圖2所示。

圖2 葉綠素熒光猝滅分析示意圖

圖像采集時期為玉米植株5葉期（V5）。由于植株可能出現下層葉片衰老脫落的現象，每盆植株共獲取4～5個葉片的熒光圖像，由植株形態學由下至上的順序標記葉片，分別記錄為“葉片1”～“葉片5”（若葉片1脫落，則只記錄“葉片2”～“葉片5”），試驗共獲得245個熒光圖像樣本。

1.3 數據分析

通過感興趣區域（Region Of Interest，ROI）的選擇對玉米植株進行圖像劃分，獲取每株玉米不同位置葉片的熒光淬滅動力學曲線、熒光參數、熒光參數圖像。本研究中使用到的主要熒光參數符號、計算式及其概念描述如表2所示。采用一維卷積移動平均對熒光淬滅動力學曲線進行降噪，并去除邊界效應，以消除環境噪聲的干擾；采用基于層次化聚類方法的非加權組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means，UPGMA）對熒光淬滅中的熒光參數進行聚類分析[24]，以度量樣本間的相似度；采用曼-惠特尼U檢驗（Mann-Whitney U test）進行葉片間的顯著性分析[25]，以更好地分析復雜環境中的樣本；使用多元回歸擬合的方法進行單個熒光參數的特征擬合；對于以多個葉片為特征的單個熒光參數以及以多個熒光參數為特征的單個葉片，采用支持向量機（Support Vector Machines，SVM）、隨機森林（Random Forest，RF）、偏最小二乘（Partial Least Squares，PLS）判別分析3個分類算法來進行玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量的判別建模[26-28]，并進行了十折交叉驗證，驗證特征的規律性強弱；使用偏最小二乘變量重要性預測（Partial Least Squares-Variable Important in Projection，PLS-VIP）對熒光參數中的特征進行評分[29]，篩選具有較高權重的特征葉片。

表2 本研究中使用的關鍵熒光參數、計算式及其概念

注：Fo：初始熒光；Fm：最大熒光；Fm_Lss：光適應后的穩態最大熒光；Fp：Kautsky誘導效應最大熒光；Ft_Lss：光適應穩態熒光；Fv_Lss：穩態可變熒光；Fq_Lss：穩態淬滅熒光。

Note: Fo: initial fluorescence; Fm: maximum fluorescence; Fm_Lss: steady-state maximum fluorescence after light adaptation; Fp: Kautsky induced effect maximal fluorescence; Ft_Lss: light-adapted steady-state fluorescence; Fv_Lss: steady-state variable fluorescence; Fq_Lss: steady-state quenched fluoescence.

2 結果與分析

2.1 葉片熒光淬滅特性垂直分布異質性分析

熒光淬滅動力學曲線表達了淬滅過程中不同時間的實際熒光產量，可通過反映PSⅡ的電子傳遞情況，表達葉片實際的光合作用強度，進而表征植物的光合性能。如圖3為2種玉米品種、2種土壤氮含量、2種土壤水含量的綜合處理下，植株不同位置的葉片的熒光動力學曲線分布圖，由熒光淬滅動力學曲線的整體分布圖得出，葉片1的總體熒光強度最低，最大熒光Fm在300～550 (a.u.)之間；葉片2次之，最大熒光Fm在500～750 (a.u.) 之間；葉片3的最大熒光Fm在700～900 (a.u.)之間；葉片4、葉片5的最大熒光Fm相近，在800～1 100 (a.u.)之間。隨著葉片高度的增加，總體熒光強度呈逐漸增大趨勢，其中，葉片1～葉片3的光合作用能力具有較高的區分度；葉片3～葉片5的曲線仍呈遞增趨勢，但差別不明顯。受到多種處理相互作用的影響，每個位置的葉片都具有較寬的誤差帶，誤差帶最寬的部分位于Fm—Fm_Lss階段，表明光適應部分的熒光參數更易受到品種、氮、水因素的影響。此外，隨著葉片高度的增加，植株葉片從Fm_L3到Fm_Lss的曲線斜率顯著增加，表明光適應過程中較高位置的葉片產生了較快的熒光淬滅。

注：圖中葉片位置編號順序為植株形態學由下至上，各葉片類別中心的加粗線為其動力學曲線的均值，兩側為曲線誤差帶。曲線上方的標記為熒光淬滅過程的關鍵節點，其中，后綴Ln為第n次脈沖的光適應熒光，Dn為第n次脈沖的暗弛豫熒光，下同。

不同的試驗樣本按照不同試驗處理可分為18組，每種處理的樣本按垂直高度上葉片的位置進一步劃分為90類樣本。在葉綠素熒光成像系統獲得的101個熒光參數中，31個為基礎熒光參數，即直接由葉綠素熒光成像系統采集獲得的參數，70個為間接熒光參數。基于上述熒光動力學曲線分布的分析，基礎熒光參數不足以表達不同樣本間的熒光淬滅特性，因此選取上述90種樣本及其對應的31個與熒光強度直接相關的參數（包含基礎熒光參數31個，間接熒光參數16個），其中，基礎熒光參數分別為葉綠素熒光淬滅分析多次脈沖過程中初始熒光Fo、Kautsky誘導效應最大熒光Fp、最大熒光Fm、光適應即時熒光Ft的系列參數（Fp包含3種計算方式，其他參數包含其光適應參數和暗弛豫參數），間接熒光參數分別為葉綠素熒光淬滅分析中可變熒光Fv、淬滅熒光Fq的系列參數（包含其光適應參數和暗弛豫參數）。對熒光參數值進行對數處理后進行了非加權組平均法聚類分析，得到垂直高度上5片葉片的熒光參數的聚類熱圖如圖4所示。受圖片尺寸限制，對顯示結果進行等距采樣，其中樣本僅顯示30類，熒光參數僅顯示24個。

根據聚類結果，樣本聚類可分為四大類。其中，第一大類以葉片1的樣本為主，且顯著區別于其他類；第二大類以葉片2為主；第三大類以葉片3的樣本為主，但較高土壤氮含量處理下先玉335的較高位葉片以及較低土壤氮含量處理下浚單20的較低位葉片也有少量樣本分布在此類；第四大類以葉片5為主，且各品種的葉片3、葉片4均有出現。綜上分析，在5片葉片的垂直分布中，葉片1與葉片2不受品種、土壤氮含量、土壤水含量的影響，其熒光淬滅過程中的熒光參數均有較為顯著的區分特征。多數樣本的葉片3具有相同的熒光特性，但浚單20和先玉335的部分葉片樣本受到環境因素的影響，垂直分布特性發生了變化。多數樣本的葉片5具有相同的熒光特性，部分較高土壤氮含量中的樣本的葉片3、葉片4也與此類樣本有類似的熒光淬滅特征。對比上述結果可進一步得出結論，鄭單958在不同土壤氮含量的條件下，垂直分布異質性較其他兩個品種變化較小，擁有更強的耐低氮能力，這與齊紅志等[33]的研究結論相符。此外，土壤水含量并未對聚類結果產生顯著的影響。

注：熱圖中熒光參數值的大小以熱圖顏色表示，顏色越深，參數值越大。樣本聚類結果中，“leaf n”代表植株形態學由下至上的第n片葉片，其他標記釋義見表1。Ft為光適應即時熒光；Fv為可變熒光；Fq為淬滅熒光，其他標記釋義見表2。

由熒光動力學曲線表征的47個熒光參數聚類為三大類，包含了不同類型信息，但同時具有一定共線性，需要利用數據挖掘產生的具有更為明確意義和普遍性的指標進行表達。

2.2 葉片熒光參數的垂直分布異質性分析

2.2.1 葉綠素熒光參數圖像分析

通過不同處理下各熒光參數成像結果的對比，篩選出了不同處理下熒光參數峰值差異顯著，且不同重復中空間分布一致性較強的3個參數：Fv/Fm、qL_Lss和Rfd_Lss。將上述3個參數的典型圖像進行了可視化對比，結果如圖5所示。

圖5 不同品種、氮環境下的葉綠素熒光成像圖

最大光量子效率Fv/Fm的分布范圍主要在0.6～0.8，且正常土壤氮含量下的Fv/Fm參數值明顯高于微量土壤氮含量，表明土壤氮含量會顯著影響葉片光合反應中心內的最大光能轉換效率。由于葉片衰老的影響，葉片1與其他葉片相比在整體上表現出了顯著的差異，但參數在各葉片內部各點的分布上差異不明顯，表明正常生長的葉片最大光能轉換效率在垂直高度上的差異性較小。

穩態光化學淬滅系數qL_Lss的分布范圍主要在0.5～1.0之間，且正常土壤氮含量下的qL_Lss參數值明顯高于微量土壤氮含量，表明土壤氮含量會顯著影響葉片光合反應中心內的光化學反應比例[34]。在垂直高度的分布上，葉片的光化學淬滅呈上升趨勢，表明較高位置的葉片具有較高的電子傳遞活性；在葉片內分布上，熒光參數較大值主要分布在葉片中部，而在葉片邊緣、葉片尖部和生長點的值較小，表明此部位在光合作用中具有較高的電子傳遞活性。

穩態熒光衰減率Rfd_Lss的分布范圍主要在0～2之間，熒光參數值的分布隨土壤氮含量的不同產生了顯著的差異。垂直分布上，微量土壤氮含量的葉片4、葉片5與較低位葉片顯著不同，而正常土壤氮含量的葉片3及其以上的葉片沒有明顯的變化，表明土壤氮含量的降低會顯著降低植株整體的葉片活性。參數在葉片內各點的分布上與參數qL_Lss類似，熒光參數較大值主要分布在葉片中部，說明此葉片部位的葉片活性較強。

綜合葉片熒光參數成像結果可知，葉片3及以上的葉片熒光參數異質性明顯降低，且顯著受到不同土壤氮含量的影響；不同玉米品種的熒光特征沒有產生顯著的成像差異，因此需要進一步研究其分布規律，探究品種間光合作用特性的顯著性差異。

2.2.2 熒光參數垂直分布異質性分析

為探究不同位置葉片熒光參數分布特性，選取了多因素綜合作用下各葉片的典型熒光參數進行分析，圖6展示了不同位置葉片關鍵熒光參數的分布差異。其中，圖6 a為各葉片的Fv/Fm分布，結果表明隨著垂直高度的增加，其最大光量子效率Fv/Fm呈明顯的上升趨勢，且葉片1與葉片2（<0.001）、葉片4與葉片5（<0.05）之間具有顯著性差異。這表明隨著垂直高度的增加，葉片的PSⅡ最大光能轉化效率增大，臨近衰老的葉片（葉片1）與正常生長的葉片相比，PSⅡ最大光能轉化效率顯著降低，新生葉片（葉片5）與正常生長的葉片相比，PSⅡ最大光能轉化效率顯著增大。圖6b為各葉片的△F/Fm’分布，結果表明隨著垂直高度的增加，其實際光量子效率均值呈上升趨勢，這表明隨著垂直高度的增加，葉片的PSⅡ實際光能轉換效率增大。葉片1與葉片2之間、葉片2與葉片3之間、葉片4與葉片5之間的差異不明顯（≤1.00）；葉片1、葉片2、葉片3與葉片4、葉片5之間具有顯著性差異（<0.001）。這表明葉片4和葉片5在實際的光合作用中具有更大優勢。圖6 c為各葉片的qL_Lss分布，結果表明隨著垂直高度的增加，光化學淬滅分3個層次顯著增加，葉片1為第一層，葉片2、葉片3為第二層，葉片4、葉片5為第三層，表明植株的光反應電子傳遞活性逐級增高，葉片4、葉片5的反應中心電子傳遞活性最強。張子山等[35]的研究表明了隨著葉片的衰老，最大光能轉換效率和電子傳遞活性均有降低趨勢，與本文上述研究結果相符。圖6 d為各葉片的NPQ_Lss分布，結果表明隨著垂直高度的增加，葉片2及其以上葉片穩態非光化學淬滅NPQ_Lss差異并不顯著，初步判斷葉片1的非光化學淬滅相對較高的主要原因是其本身光合機構的老化。

2.3 葉片光合特性的垂直分布規律探究

2.3.1 不同處理下葉片光合特性垂直分布規律研究

為了探究不同處理下植株葉片光合特性的垂直分布規律，對上述處理的葉片關鍵熒光參數在垂直方向的分布進行了擬合，如圖7所示。由圖7 a可知，不同土壤氮含量處理樣本的Fv/Fm參數在95%水平下有顯著的二次函數分布特征，隨著葉片高度的增加，PSⅡ反應中心內的最大光能轉換效率呈增大趨勢，且增幅越來越小，表明新生葉片的最大光合作用效率高于較早生長的低位葉片，且隨葉片高度的增加，葉片間的最大光能轉換效率差距逐漸縮小。此外，對植株不同氮含量處理會顯著影響熒光參數的垂直分布特性，隨著土壤氮含量的增加，垂直分布曲線的二次項系數和截距均呈增大趨勢，整體曲線的高度增加，且微量土壤氮含量條件對垂直分布產生了更大的影響，其葉片4的Fv/Fm到達了曲線最高點，這是因為土壤氮含量會顯著影響葉片蛋白質生成，進而影響其葉綠素含量，導致低位葉片的較早衰老，高位葉片養分不足[36]。由圖7b可知，不同品種間的qL_Lss參數分布近似于一次函數，隨著垂直高度的增加，樣本的光化學淬滅呈增加的趨勢，3個品種的斜率從大到小依次為鄭單958、先玉335、浚單20，說明其光反應電子傳遞活性垂直分布差異依次減小；鄭單958的曲線擬合F值顯著大于其他兩個品種，表明該品種葉片qL_Lss參數線性分布規律更強，進而說明不同氮含量處理對該品種葉片光化學淬滅的差異影響較小，驗證了該品種對土壤氮含量有較強的抗逆性[37]。

a. Fv/Fmb.△F/Fm’c. qL_Lssd. NPQ_Lss

注：相鄰葉片的曼-惠特尼U檢驗結果在圖中標出，其中“*”代表≤0.05；“**”代表≤0.001。

Note: The results of the Mann-Whitney U test for adjacent leaves have been marked in the figure, where “*” represents≤0.05; “**” represents≤0.001.

圖6 多因素影響下各葉片熒光參數分布差異

Fig.6 Differences in the distribution of fluorescence parameters of leaves under the influence of multiple factors

圖7 部分熒光參數在不同處理條件下的垂直分布規律

為了進一步探究玉米植株在多種處理條件下的垂直分布規律，以葉片熒光參數分類植株組別的能力來量化葉片垂直分布規律性強弱。本試驗以同一植株5葉片的熒光參數為特征，選擇典型機器學習分類算法建立玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量的判別模型。模型建立時采用十折交叉驗證的方法進行數據集劃分以保證數據分布的一致性，并避免過擬合的產生。關鍵熒光參數在3種分類器下的判別準確性結果如表3所示。

表3 關鍵熒光參數在3種分類器下的樣本類型判別準確率

注：SVM、RF、PLS分別為支持向量機、隨機森林和偏最小二乘算法。

Note: SVM, RF, PLS are support vector machines, random forest, partial least squares, respectively.

為充分表達整體判別效果，將3種分類器判別結果的平均值作為熒光參數的評估標準。由判別結果分析，對玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量判別的最佳熒光參數分別為Fv/Fm、Fv/Fm和NPQ_Lss，其平均判別準確率分別為60.00%、71.33%和66.67%，均高于隨機判別準確率33.33%、33.33%和50.00%。選擇判別準確率最高的分類器模型，并分別繪制上述特征熒光參數的交叉驗證混淆矩陣，如圖8所示。

玉米品種的判別分析中，Fv/Fm的準確率相對較高，表明不同玉米品種PSⅡ最大光能轉換效率的垂直分布規律性最強，其中，以鄭單958的最大光量子效率垂直分布規律性最為顯著，如圖8a所示。在土壤氮含量的判別分析中，Fv/Fm的判別準確率最高，表明不同土壤氮含量下PSⅡ最大光能轉換效率的垂直分布規律性最強，進一步說明土壤氮含量會對葉片光能轉換效率產生影響。如圖8b所示，由交叉驗證混淆矩陣可知，微量氮含量的判別準確率達0.94，遠超其他兩個水平，可知玉米植株在環境嚴重缺少氮元素的情況下其生長發育有極高的概率會受到影響，在環境少氮的情況下，有50%以上的概率其生長發育會受到影響。在土壤水含量作用下，3種判別方法的效果均不夠理想，其中非光化學淬滅NPQ_Lss的判別準確率相對較高，由圖8c NPQ_Lss的交叉驗證混淆矩陣可知，植株有0.88的概率在干旱脅迫后，垂直分布規律產生變化。

a. 玉米品種偏最小二乘判別中的Fv/Fm參數a. Fv/Fm in PLS of maize varieties discriminationb. 土壤氮含量隨機森林判別中的Fv/Fm參數b. Fv/Fm in RF of soil nitrogen content discriminationc. 土壤水含量支持向量機判別中的NPQ_Lss參數c. NPQ_Lss in SVM of soil water content discrimination

由于試驗樣本是在多個脅迫因素綜合作用下培育，可能加劇了不同樣本間的差異，導致在葉片光合特性的垂直分布規律研究中，樣本的規律性沒有得到很好地體現。具體表現在：不同土壤氮含量條件下的曲線擬合值不穩定，不同土壤水含量條件下的特征擬合結果2較低，土壤水含量分類判別準確率較低等。擬在后續研究中適當增加水分脅迫組別和程度，進一步揭示水脅迫對光合特性垂直分布規律的影響；針對作物生長期對垂直分布規律具有顯著影響，延長作物的生長至10葉期，探究不同生長階段光合特性垂直分布的變化；擴大樣本數量，減小微氣候或個體差異產生的影響。

2.3.2 植株葉片垂直光合異質性關鍵葉片研究

為了探究葉片垂直分布中影響樣本類型判別的關鍵葉片，基于上述分類結果，選取了品種、土壤氮含量、土壤水含量判別分析中的最優熒光參數進行偏最小二乘變量重要性預測（PLS-VIP），以進一步進行特征變量篩選。同時，以每片葉片的5個關鍵熒光參數（見表2）為特征，使用支持向量機、隨機森林、偏最小二乘判別分析3種判別方法來進行玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量的建模及預測。將各位置葉片的平均判別結果按葉片位置繪制成趨勢圖，各位置葉片的變量VIP得分和平均判別準確率結果如圖9所示。

a. 玉米品種判別a. Varieties differentiationb. 土壤氮含量判別b. Nitrogen content differentiationc. 土壤水含量判別c. Water content differentiation

如圖9a所示，在玉米品種判別分析中，基于單個熒光參數（Fv/Fm）、多個葉片為特征的特征變量選擇和基于多個熒光參數、單個葉片為特征的判別分析表現出相同的趨勢，且均在葉片2上展現出較高的判別性能。這表明葉片2可以作為玉米品種判別的“特征葉片”。如圖9b所示，在土壤氮含量判別分析中，在以單個熒光參數（Fv/Fm）、多個葉片為特征的特征變量選擇中，葉片1、葉片2判別均產生了有效貢獻（VIP得分大于1），且葉片1的得分較高；在以多個熒光參數、單個葉片為特征的判別分析中，葉片2具有最高的平均判別準確率。因此，葉片2可以作為土壤氮含量判別的“特征葉片”。如圖9c所示，在土壤水含量判別分析中，基于單個熒光參數（NPQ_Lss）、多個葉片為特征的特征變量選擇和基于多個熒光參數、單個葉片為特征的判別分析表現出相同的趨勢，且在葉片1、葉片5上展現出較高的判別性能，但葉片1的特征評分和判別準確率均略高于葉片5，表明葉片1可以作為土壤水含量判別的“特征葉片”。

3 結 論

本研究以3種玉米品種在3種氮含量和2種水含量環境下的苗期植株為研究對象，利用葉綠素熒光成像技術，從葉綠素熒光淬滅特性、葉綠素熒光參數特征、葉綠素熒光參數垂直分布規律、垂直分布異質性關鍵葉片4個方面進行了植株葉片光合特性的垂直分布研究。主要有以下結論：

1）在葉綠素熒光淬滅特性上，植株形態學由下至上的第1和第2片葉片（葉片1和葉片2）不受品種、土壤氮含量的影響，其淬滅特性均有較為顯著差異。鄭單958在不同土壤氮環境下的熒光淬滅異質性小于先玉335和浚單20，擁有更強的耐低氮能力。

2）在葉綠素關鍵熒光參數垂直分布上，參數Fv/Fm表明衰老、正常、新生葉片的光合作用最大光能轉換效率依次顯著增大，該特征在葉片內部各點的分布上差異性較小；參數△F/Fm’表明植株形態學由下至上的第4和第5片葉片（葉片4和葉片5）的實際光能轉換效率具有顯著優勢；參數qL_Lss表明光反應電子傳遞活性隨垂直高度的增加分3個等級逐級增大；參數NPQ_Lss表明葉片的非光化學能量耗散在正常葉片中差異性較小，在衰老葉片中顯著增大。

3）葉綠素熒光參數垂直分布規律上，不同熒光參數的垂直分布擬合效果均不夠理想。其中，參數Fv/Fm在不同的土壤氮含量下的垂直分布與二次曲線有較高的擬合特征，隨著土壤氮含量的降低，垂直分布的異質性增大；qL_Lss在不同品種間的垂直分布與一次曲線有較高的擬合特征，垂直分布異質性表現由大到小依次為鄭單958、先玉335、浚單20，鄭單958的抗逆性較強。支持向量機、隨機森林、偏最小二乘判別分析的判別結果表明，Fv/Fm對不同玉米品種的判別準確率最高，鄭單958樣本的判別準確率達0.82，垂直分布規律更顯著；Fv/Fm對不同土壤氮含量的判別準確率最高，微量土壤氮含量下的樣本判別準確率達0.94，垂直分布規律更顯著；NPQ_Lss對不同土壤水含量的判別準確率較高，干旱環境下的樣本判別準確率達0.88，垂直分布規律性更顯著。

4）在玉米品種和土壤氮含量的分析中，葉片2可以作為區分玉米品種的“特征葉片”；在土壤水含量的分析中，葉片1可以作為土壤水含量評估的“特征葉片”。

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Vertical distribution of photosynthetic characteristics of maize leaves at the seedling stage using chlorophyll fluorescence imaging

Xiao Tianpu, Yang Li, Zhang Dongxing, Wang Liangju※, Zhang Tianliang, Du Zhaohui, Li Hongsheng, Xia Xulong

(1.,,100083,; 2.,100083,)

Leaf photosynthetic characteristics of maize seedlings can greatly contribute to the accuracy of phenotype detection. This study aims to determine the vertical distribution of leaf photosynthesis in three maize varieties at the seedling stage (five-leaf stage). The chlorophyll fluorescence imaging was also utilized to clarify the combined influence of different environmental nitrogen and water content. The results were as follows. 1) The leaf 1 and leaf 2 were not affected by the species, nitrogen, and water treatment, in terms of the chlorophyll fluorescence quenching, indicating the more significantly different fluorescence intensities. The unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis was conducted to produce the four levels of differentiation with the leaf position as the dominant factor. The clustering of ZD 958 was less heterogeneous than XY 335 and JD 20 under different environmental factors. There were no outstanding clustering characteristics for the nitrogen and water content. 2) In the vertical distribution of key chlorophyll fluorescence parameters, the parameter Fv/Fm indicated that there was a significant increase in the maximum photosynthetic light energy conversion efficiency of senescent, normal, and neonatal leaves in sequence. There was no variation in the feature within the leaves. The parameter △F/Fm' indicated that the high morphological positions were greatly contributed to the actual light energy conversion efficiency of the two leaves. The parameter qL_Lss indicated that the photoreactive electron transfer activity increased in the three steps with the increase of vertical height. The parameter NPQ_Lss indicated that the less variable non-photochemical energy dissipation was found in the normal leaves, but the significant increase in the senescent leaves. 3) A high fitting characteristics with the quadratic function were found in the vertical distribution of the maximal PSⅡ efficiency (Fv/Fm) at the different ambient nitrogen levels. The heterogeneity of the vertical distribution increased, as the ambient nitrogen level decreased. A high fitting characteristics with the primary function were also found in the vertical distribution of the steady-state light-adapted quenching (qL_Lss) at the different varieties. The heterogeneity of the vertical distribution was ranked in the order of the ZD 958 > XY 335 > JD 20. Among them, the ZD 958 was more resistant to the stress. A comparison was made on the Support Vector Machines (SVM), Random Forest (RF), and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA). The maximal PSⅡ efficiency (Fv/Fm) of ZD 958, the samples under the trace ambient nitrogen content, and the steady-state non-photochemical quenching (NPQ_Lss) of samples under the drought environment were detected with 0.82, 0.94, and 0.88 accuracy, respectively. There was much more significant pattern of vertical distribution compared to other treatments and fluorescence parameters. 4) The plant leaves were numbered from the bottom to the top in the “key leaf” analysis of leaf photosynthetic heterogeneity. The “key leaf” was then selected as the second leaf, second leaf and first leaf for the identification of maize varieties, the environmental nitrogen, and water content assessment in the discriminant analysis of varieties, water, and nitrogen content treatment, respectively.

chlorophyll fluorescence; photosynthesis; maize; vertical distribution

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.018

S126

A

1002-6819(2022)-16-0162-10

肖天璞，楊麗，張東興，等. 基于葉綠素熒光成像的玉米苗期葉片光合特性垂直分布[J]. 農業工程學報，2022，38(16)：162-171.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.018 http://www.tcsae.org

Xiao Tianpu, Yang Li, Zhang Dongxing, Wang Liangju, et al. Vertical distribution of photosynthetic characteristics of maize leaves at the seedling stage using chlorophyll fluorescence imaging[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(16): 162-171. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.018 http://www.tcsae.org

2022-03-25

2022-08-11

國家自然科學基金項目（32071915）

肖天璞，博士生，研究方向為數字農業信息獲取。Email：xtianpu@163.com

王糧局，博士，副教授，研究方向為植物表型、畜禽信息智能感知。Email：wangl@cau.edu.cn