采用高效液相色譜儀串聯示差折光檢測器分析原料糖漿中低聚麥芽糖組分方法的探討

徐煜琪

上海工微所科技有限公司，上海 200233

麥芽糖(maltose)是由兩個葡萄糖經α-1,4糖苷鍵連接而成的二糖，又稱為麥芽二糖。因C1羥基位置不同，而分為α-和β-兩種異構體[1]。

低聚麥芽糖一般是以淀粉為原料，經酶法生產含3～8個葡萄糖分子的碳水化合物，能經小腸逐步消化吸收。低聚麥芽糖的滲透壓為葡萄糖的1/4，其甜度為蔗糖的40%，生理特點是被吸收利用的速度比單糖和雙糖慢，一次攝入后可以維持較長時間的能量補充；同時，維持胰島素和血糖之間的相對平衡[2]。

奶糖糖果，是以食糖或糖漿或甜味劑、乳制品等為主要原料，制成具有乳香味的糖果[3]。在奶糖糖果中，膠質型奶糖糖果多數以低聚麥芽糖漿為底料。而其中，麥芽四糖(maltotetraose)與麥芽五糖(maltopentaose)對膠質型奶糖糖果口感的影響尤其顯著，隨著麥芽五糖的的比例升高，膠質型奶糖糖果會更硬，反之亦然[3]。同時，麥芽四糖和麥芽五糖的價格也相對較高。因此在原料麥芽糖漿中，麥芽四糖與麥芽五糖在糖漿中的占比就顯得尤其重要。快速、有效的檢測原料糖漿中麥芽四糖與麥芽五糖就有著重要的意義。

現在，低聚麥芽糖的液相分析方法，常用的色譜柱有鈣柱、糖柱、氨基柱等類型。最常用的為離子交換型色譜柱，配合使用檢測器為蒸發光散射檢測器(EvaporativeLight-scattering Detector，ELSD)，或脈沖安培檢測器(Pulsed Amperometric Detector，PAD)[4-5]，也有報道使用高效液相色譜串聯電噴霧檢測器(HPLC-CAD)來檢測糖類物質[6]。但由于鈣柱、糖柱等價格高，分析參數單一；蒸發光散射檢測器(ELSD)和脈沖安培檢測器(PAD)的購置成本、維護成本和維護要求都很高，而且檢測器通用性差。對于日常的低聚麥芽糖漿驗收而言，成本過高，實際應用性較差。

示差折光檢測器(Refractive Index Detector，RID)是根據不同物質具有不同的折射率來進行組分監測。凡是具有與流動相折射率不同的組分，均可以使用這種檢測器[7-8]。示差折光檢測器(RID)分為反射式和折射式兩種。作為通用型檢測器，示差折光檢測器(RID)能分析無紫外吸收的物質，尤其是糖類，使用方便，設置簡單，大多食品檢測實驗室都有配備。

參考GB 5009.8—2016 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定[9]，GB/T 20881—2007 低聚異麥芽糖[10]，GB/T 20883—2017 麥芽糖中，提及對葡萄糖，麥芽糖，低聚麥芽糖的測定方法[11]，如使用常規的外標法進行定量計算，需購置單一的純度較高的低聚麥芽糖的標準品，成本較高。因此本文使用標準物質根據保留時間進行初步定位，然后采用面積歸一法，計算低聚麥芽糖各組分含量。可降低成本，同時也具有一定的參考價值。

1 實驗方法

1.1 實驗標準品及試劑

葡萄糖純度標準物質(純度99.0%)，D-麥芽糖(純度94.9%)，麥芽三糖(96.0%)，麥芽四糖(99.0%)(上海安譜實驗科技股份有限公司)。乙腈購買于上海迪馬科技有限公司。實驗使用水都為一級水。

1.2 實驗儀器及設備

METTLER TOLEDO 電子天平MS204S/02，METTLER TOLEDO 電子天平XS205 DualRange，IKA VORTEX GENIUS 3渦旋振蕩器，Agilent LC1260液相色譜儀(Agilent 1260 Quat Pump VL G1311C四元泵，Agilent 1260ALS G1329B自動進樣器，Agilent 1260TCC G1316A柱溫箱，Agilent 1260RID G1362A示差折光檢測器)，Waters XBridge? BEH Amide 5 μm×4.6 mm×250 mm Column色譜柱+Waters XBridge? BEH Amide 5 μm VanGuard? Cartridge 3.9 mm×5 mm保護柱。

1.3 實驗過程

準確稱取2.0 g樣品于100 mL容量瓶中，加30 mL一級水溶解樣品，渦旋1 min后，用水定容至刻度，混勻后，過0.45 μm水相微孔膜后，供儀器檢測。

分別準確稱取葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖標準品0.010 g，用一級水溶解后，定容至10 mL，各取4種標準溶液2.00 mL，用一級水定容至10 mL后，過0.45 μm水相微孔膜后，供儀器檢測。

1.4 液相條件

采用乙腈-水在不同的配比下，配合不同的柱溫條件，考察各組分的分離度。

采用乙腈-水比例為50∶50、55∶45、60∶40。流速設置為1.0 mL/min，柱溫箱溫度設定為：30 ℃、35 ℃、40 ℃。檢測器溫度設定為40 ℃。

2 結果與討論

2.1 不同流動相比例的比較

在柱溫箱設置溫度為30 ℃時，采用不同的乙腈與水的混合比，對低聚麥芽糖標準品混合樣品進行高效液相色譜分析，得到相應圖譜。

采用乙腈∶水=50∶50，如圖1所示，各組分不能分離。

圖1 乙腈∶水=50∶50葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖標樣色譜圖

采用乙腈∶水=60∶40，如圖2所示，各組分可以完全分離，但是隨著聚合度提高，色譜峰有前沿，而且所需檢測的糖漿中，有聚合度>5以上的低聚麥芽糖，單個樣品所需檢測時間較長。

圖2 乙腈∶水=60∶40葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖標樣色譜圖

采用乙腈∶水=55∶45，如圖3所示，出峰順序依次為：葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖。各色譜峰峰型較好，保留時間合適，且考慮所需檢測的糖漿中聚合度 >5以上的的低聚麥芽糖出峰時間推斷，一般檢測單一樣品的時間不超過20 min。因此，采用乙腈∶水=55∶45最為合適。

圖3 乙腈∶水=55∶45葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖標樣色譜圖

2.2 不同柱溫箱溫度的比較

查詢色譜柱說明書顯示，該色譜柱一般耐受溫度為50 ℃以下，因此在乙腈∶水=55∶45條件下，柱溫箱設置30 ℃，35 ℃，40 ℃下，觀察個組分分離情況，如圖4、圖5、圖6所示，各組分分離度基本相似，但隨著柱溫升高，色譜柱的使用壽命會有所下降，因此將柱溫箱溫度設為30 ℃。

圖4 柱溫箱設置為30 ℃下色譜圖

圖5 柱溫箱設置為35 ℃下色譜圖

圖6 柱溫箱設置為40 ℃下色譜圖

2.3 不同色譜柱的對比

Waters XBridge? BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色譜柱(下文以BEH色譜柱表示)，液相條件：流動相乙腈-水=55∶45，流速1.0 mL/min，柱溫箱設置為30 ℃，示差折光檢測器(RID)設置為40 ℃。HPLC Carbohydrate Analysis Column Aminex HPX-42A Carbohydtate Column 300 mm×7.8 mm色譜柱(下文以HPX-42A色譜柱表示)，液相條件：流動相為水，流速0.5 mL/min，柱溫箱設置為85 ℃，示差折光檢測器(RID)設置為50 ℃。鈣柱，液相液相條件：流動相為水，流速0.5 mL/min，柱溫箱設置為90 ℃，示差折光檢測器(RID)設置為35 ℃。其中，HPX-42A色譜柱、鈣柱的的液相條件由糖漿供應方提供。在進行樣品檢測時，為降低成本，本文并未購買麥芽五糖及以上的標準品，而是默認其按照保留時間依次出峰，采用面積歸一化法進行定量計算，分析結果見表1。

表1 不同色譜柱對同一樣品分析結果

如圖7所示，使用BEH色譜柱時，糖漿原料中，各多聚麥芽糖分離完全，無峰重疊，但在聚合度>8以上時，色譜峰扁平，峰型相對較差，但在實際應用中，考慮到更多關注的是麥芽三糖，麥芽四糖的含量，最后高聚合度麥芽糖含量較低，影響較小。

圖7 Waters XBridge? BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色譜柱

如圖8所示，使用HPX-42A時，麥芽十糖及以下組分基本分離，但仍有重疊，尤其是麥芽六糖及以上多聚麥芽糖，重疊較為嚴重，而且色譜峰都有前沿現象。

圖8 HPLC Carbohydrate Analysis Column Aminex HPX-42A Carbohydtate Column 300 mm Column色譜圖

以上兩種色譜柱雖然出峰順序不同，但檢測結果大致上相差不大的，可以通過比對簡單地進行糖漿的驗收，不至于完全受制于供應商的檢測結果。

如圖9所示，使用鈣柱時，麥芽五糖及以上未能完全分離，而且與進樣峰重疊在一起，并且麥芽四糖、麥芽五糖分離不完全，數據偏差較大，可供參考意義不大。

圖9 鈣柱色圖譜

3 結論

使用高效液相色譜儀串聯示差折光檢測器(HPLC-RID)，采用Waters XBridge? BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色譜柱，流動相為乙腈∶水=55∶45，柱溫箱溫度設置為30 ℃，示差折光檢測器(RID)溫度設置為40 ℃，使用定性分析和面積歸一化法相結合的方法，能基本計算出麥芽糖漿各個組分含量。糖果企業可參考該方法對原料糖漿進行驗收，對糖漿的組分含量做到心中有數，從而在采購時掌握主動權。