微生物發酵酉素方對脾虛證小鼠的影響※

官清華 黃君陽 陳炳焜 連蓮香 蔡韶芳 饒線明▲

功能性消化不良（functional dyspepsia,FD）約占我國脾胃病門診量的50%[1]，西醫治療以抑酸、促進胃動力、抗焦慮抑郁等為主[2]，但療效不甚理想，而中醫從“脾虛”辨證治療FD 具有確切作用[3]。相關研究表明，現代微生物發酵中藥具有提高中藥活性成分利用率、增強中藥藥效、降低中藥不良反應、節省藥材資源、保護生態環境等優點[4]，同時也能達到標準質控和開展規模生產，故筆者將多年臨床實踐用于FD 治療的酉素方，通過新型微生物發酵配制，對脾虛證小鼠胃腸功能與免疫功能進行相應實驗研究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級ICR 小鼠80 只，體質量18～22 g，雌雄各半，由閩侯縣上街行難實驗動物工作室提供。動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。分籠飼養于室溫20～26 ℃的環境，經3 d過渡喂養。

1.2 發酵方法發酵酉素方（黨參10 g，茯苓15 g，淮山30 g，炒白術10 g，谷芽6 g，黃芪10 g，薏苡仁30 g，芡實30 g，扁豆30 g，馬蹄金30 g，菜豆殼30 g，陳皮10 g，木香10 g，炙甘草3 g）按藥材總質量與清水1∶5的比例，用夾層罐通蒸汽加熱，待溫度達95 ℃開始計時，保持微沸1 h，期間控制溫度在95 ℃以上，煎煮60 min，過濾藥液，并進行酶解和滅酶滅菌處理，按10%接種量接種活化種子液（含5%植物乳桿菌活化種子液、5%嗜酸乳桿菌活化種子液），于40 ℃條件下發酵3 d，再將中藥發酵液置于15～20 ℃條件下后發酵2 d，離心過濾和超濾處理，并進行低溫真空濃縮處理。

1.3 主要試劑與儀器活性炭粉；阿拉伯樹膠；小鼠胃動素檢測試劑盒；酶標定測量儀（ThermoFisher）；高速離心機；灌胃針。

1.4 動物分組、造模及給藥將80 只ICR 小鼠按體重和性別隨機分為4組：空白對照組、模型組、發酵酉素方低劑量組和發酵酉素方高劑量組。空白對照組常規飼養，自由飲食飲水。其余各組采用飲食不節加勞倦過度的復合造模法制備脾虛小鼠模型，即第1 d至第12 d，單日禁食不禁水，不限量喂食甘藍，游泳至耐力極限（即指小鼠口鼻部首次浸入水中）；雙日根據小鼠體重按0.02 mL/g喂食豬油。模型小鼠出現便溏（嚴重者脫肛）、皮毛枯槁、拱背納呆、體重減輕、瞇眼等癥狀即表示造模成功。

造模成功后，從第13 d開始，空白對照組和模型組予蒸餾水灌胃。發酵酉素方低劑量組給予低濃度酉素方溶液（濃度22.32 g/kg，為成人單位公斤體重的1倍量），發酵酉素方高劑量組給予高濃度酉素方溶液（濃度59.81 g/kg，為成人單位公斤體重的2.68倍量），每日早晚各灌胃給藥1 次，連續給藥7 d。灌胃量按小鼠體重0.3 mL/10 g給藥。

1.5 觀察指標

1.5.1 小鼠一般情況 記錄小鼠體重、體征變化，包括毛色、有無拱背、運動狀況、飲食狀況、大便性狀、有無瞇眼、有無脫肛等。

1.5.2 消化道排空速率的測定 第7 d 灌服給藥后20:00 起禁食不禁水12 h，第8 d 早上8:00 每只小鼠根據體重按0.02 mL/g 灌服5%活性炭阿拉伯膠混懸液，30 min 后迅速脫臼處死，剖開腹腔，取出小腸（自幽門至回盲部）。將小腸管不加牽引地平鋪在玻璃板上，以幽門為起點，測量炭末在腸管內的移動距離（cm）和小腸全長（cm），計算每只小鼠活性炭的移動距離占小腸全長的百分比（%），其值越大則消化道排空速率越快。

1.5.3 胸腺和脾臟臟器指數的測定 小鼠脫臼處死后，解剖取胸腺和脾臟，分別稱取胸腺和脾臟重量（mg），計算臟器與體質量（g）之比，即為胸腺和脾臟指數（mg/g）。其值越大提示免疫功能強。

1.5.4 胃腸激素的測定 連續給藥7 d 后摘取小鼠眼眶，取血采集血清，按試劑盒方法測定和計算小鼠血清胃動素（MTL）濃度。

1.6 數據處理方法定量數據以均數±標準差()表示，采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理，在滿足參數檢驗的前提下，運用方差分析檢驗實驗結果。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況比較以復合造模法喂養12 d 后，模型組、發酵酉素方低劑量組和高劑量組小鼠多出現毛發稀松無光澤、體形消瘦、腹部兩側凹陷、背微弓、大便稀溏、神情萎靡、瞇眼等癥狀或體征，體重顯著低于空白對照組（P＜0.01），提示脾虛證小鼠造模成功。治療后，與模型組比較，發酵酉素方高、低劑量組小鼠的毛發較順亮、食量較大、行為較活躍，體重增加（P＜0.01），而高劑量組與低劑量組比較無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體重比較（g，）

表1 各組小鼠體重比較（g，）

注：與空白對照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

2.2 各組小鼠消化道排空速率、MLT水平比較與空白對照組比較，模型組的消化道排空速率、MLT 水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，發酵酉素方高劑量組小鼠的消化道排空速率、MLT 水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠消化道排空定量指標觀測結果（）

表2 各組小鼠消化道排空定量指標觀測結果（）

注：與空白對照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

2.3 各組小鼠胸腺和脾臟臟器指數比較與空白對照組比較，發酵酉素方高劑量組的胸腺指數升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，發酵酉素方高劑量組小鼠的胸腺指數、脾臟指數升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠臟器指數定量指標的觀測結果（）

表3 各組小鼠臟器指數定量指標的觀測結果（）

注：與空白對照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

3 討論

現代醫學認為FD 的發病因素及機制呈多元化，與胃腸功能障礙、心理精神因素、胃腸激素改變、幽門螺桿菌感染、炎癥、內臟高敏感性、特定基因型改變與遺傳易感性、早期生活應激等有關。西醫主要采取對癥治療，病情易反復，療效滿意度較差。中醫認為FD主要是以脾胃虛弱為本，氣機阻滯為標，因此尤其注重健脾補虛來治療消化系統疾病。以飲食不節加勞倦過度的復合造模法制備的脾虛動物模型，無其他藥物干擾且更符合臨床特點，可用于相關中藥的藥理學研究。

酉素方系第三批全國名老中醫陳炳焜及饒線明師徒二人臨床多年用于治療FD 的有效實踐方，全方按照中醫健脾益氣，藥食同源的思路組合，以四君子湯為基礎，佐藥食同源之品，結合當地草藥合制而成。四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，由黨參、茯苓、白術和甘草四味中藥組成。方中君藥黨參具有補氣健脾養胃的功效；臣藥白術味甘、苦，性溫，可補氣健脾、燥濕利水；佐藥茯苓味甘、淡，性平，可利水滲濕、健脾化痰；使藥甘草味甘，性平，可益氣滋養、通陽復脈。諸藥共用以益氣健脾，為祖國傳統醫學補益脾胃之名方[5]。Meta 分析[6]結果顯示，四君子湯加味治療FD 在總有效率方面優于常規西藥組。酉素方中有淮山、芡實、扁豆、薏苡仁等藥食同源補脾之品，通過影響消化系統、內分泌系統、免疫系統等相關功能以達到健脾的作用[7]，方中地方草藥馬蹄金[8]、菜豆殼[9]常被用于理氣消脹，能有效緩解FD癥狀。

但是，由于FD 患者眾多，傳統中藥煎煮費時耗力，無法統一質控和規模生產，因此需要結合現代工藝進行藥劑轉化，以期滿足眾多患者便捷服用的需求。目前，現代發酵工程技術既可滿足標準質控、規模生產、方便攜帶的現實需要，又可以有效提取中藥活性成分，提高中藥利用率，減低中草藥毒性[4]。陳旸等[10,11]利用植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對人參進行發酵，將有效成分人參總苷轉化為小分子單體人參皂苷Rd 和稀有人參皂苷Rg，有效提高人參有效成分活性與功能性。王身艷[12]采用藥用真菌使草烏發酵，降低了草烏中劇毒成分烏頭堿、中烏頭堿與次烏頭堿的含量，而增加了毒性較小的苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰中烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿的含量。故本實驗利用現代發酵工程技術，以新型微生物發酵制備酉素方藥液，對脾虛證小鼠進行實驗研究。實驗中采用飲食不節加勞倦過度的復合造模法制備脾虛證小鼠模型，結果顯示脾虛證小鼠造模成功。通過對成功造模的脾虛證小鼠給予發酵酉素方進行治療發現，高劑量酉素方對于脾虛模型小鼠的體重變化、消化道排空速率、胃動素濃度以及臟器指數都有較顯著的改善，進一步證實新型微生物發酵酉素方對脾虛小鼠的胃腸功能和免疫功能有較好的調節作用。因此本研究提示，新型微生物發酵酉素方可通過調節胃腸功能和免疫功能而用于治療FD。本研究的不足之處在于未開展陽性藥物組與酉素方（不發酵）組對脾虛小鼠影響的比較實驗，將在今后研究中進一步予以探討和證實。

綜上，本動物實驗研究證實了新型微生物發酵酉素方有助于調節胃腸功能和免疫功能，后期可進一步探討高劑量酉素方的微生物發酵法與傳統煎煮法的優劣及其作用機制的差異，為廣大FD 患者提供簡便效廉的健康服務新途徑。