4 株致病性大腸桿菌致犢牛腹瀉的分離鑒定及毒力與耐藥性分析

張 歡，胡朝輝，勾耀鵬，王 亮，齊亞銀＊

1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊 830000

3 新疆泰昆集團(tuán)有限責(zé)任公司，新疆昌吉 831100

0 引言

犢牛是牧場的未來，承載整個牧場的發(fā)展，對牧場盈利能力有著深遠(yuǎn)的影響。犢牛腹瀉是影響新生犢牛健康的主要疾病之一[1]。犢牛腹瀉嚴(yán)重影響其平均日增重和首個泌乳期矯正產(chǎn)奶量，經(jīng)過抗生素治療的腹瀉犢牛的首個泌乳期產(chǎn)奶量損失可達(dá)到493 kg，還會導(dǎo)致受胎率降低，產(chǎn)犢率降低等[2]。造成犢牛腹瀉的主要因素有以下方面：一是細(xì)菌因素，主要是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌引發(fā)。二是病毒因素，主要由輪狀病毒、冠狀病毒、BVD病毒引起。三是寄生蟲因素，主要由以隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲引起[3]。四是飼養(yǎng)管理因素，包括飼喂不當(dāng)及外界環(huán)境冷熱刺激應(yīng)激等[3]。其中，大腸桿菌是引起新生犢牛腹瀉的主要細(xì)菌性病原菌，普遍存在于牧場的環(huán)境里，且由于治療中大劑量使用抗生素導(dǎo)致耐藥菌增加，對抗生素抵抗力顯著增強(qiáng)，治療難度加大。犢牛大腸桿菌病主要表現(xiàn)為腸炎或敗血癥等癥狀。1～20日齡犢牛如患病不及時治療易死亡[4]。本文為確定導(dǎo)致新疆奎屯地區(qū)某牧場犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀的病原，對瀕死新生犢牛病變臟器致病菌進(jìn)行分離鑒定和一般生物學(xué)特性的研究，為該牧場犢牛腹瀉的防控和治療提供參考。

1 主要試劑與儀器

LB肉湯培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染液、細(xì)菌生化鑒定微量發(fā)酵管，海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，杭州濱河微生物試劑有限公司；引物，上海生工生物工程股份有限公司；光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯公司；全自動振蕩培養(yǎng)箱、隔水式恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；高壓滅菌器，日本Hirayama公司；PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱，賽默飛公司。

2 方法

2.1 樣品來源

2022年3月無菌采集北疆地區(qū)某牧場2 份病死犢牛腸系膜淋巴結(jié)。解剖后快速放入裝有冰袋的采樣箱，備用。

2.2 分離鑒定

將樣品在超凈工作臺中取出，使用長柄鑷子夾取酒精棉球點(diǎn)燃灼燒樣品表面，以達(dá)到殺滅表面細(xì)菌的作用，避免環(huán)境中細(xì)菌污染；使用高壓滅菌后的剪刀剪開樣品，取綠豆大小臟器組織置于裝有含有5 mL LB肉湯培養(yǎng)基的試管中。編號后放于搖床中增菌12 h，次日取出少量渾濁菌液于載玻片上涂開，革蘭氏染色后，觀察鏡檢結(jié)果；用接菌環(huán)取少量渾濁菌液在伊紅美蘭固體培養(yǎng)基中進(jìn)行四區(qū)劃線，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后觀察，次日挑取黑紅色具有金屬光澤的單個菌落，置于裝有5 mL LB肉湯培養(yǎng)基的試管中增菌培養(yǎng)12 h，得到純化后的菌液。

2.3 生化鑒定

按照生化鑒定試劑/鑒定管說明書進(jìn)行操作。

2.4 PCR 鑒定

本試驗(yàn)以純化后的菌液作為PCR反應(yīng)體系中的模板。細(xì)菌16 sRNA通用引物序列大小為1540 bp，見表1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)。

表1 細(xì)菌16sRNA通用引物序列

2.5 大腸桿菌分離株常規(guī)毒力基因檢測

本試驗(yàn)以細(xì)菌16sRNA引物鑒定后的分離株為模板，參照大腸桿菌毒力基因引物（表2）[5]反應(yīng)程序和體系進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn) 。

表2 大腸桿菌毒力基因

2.6 藥物敏感性試驗(yàn)

選取9 種牧場常用的藥物，在超凈工作臺內(nèi)吸取200 μL培養(yǎng)后的純菌液，分散滴在腦心浸出液瓊脂平板上，然后使用滅菌過的涂布棒順時針涂勻直至培養(yǎng)基表面光滑，最后將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上并在相應(yīng)的位置進(jìn)行標(biāo)記，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，量取各個藥敏紙片抑菌環(huán)的直徑。根據(jù)NCCLS（美國臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會）標(biāo)準(zhǔn)判定試驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 大腸桿菌鑒定結(jié)果

腸系膜淋巴結(jié)在LB肉湯培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后鏡檢可觀察到大量兩端鈍圓革蘭氏陰性短桿菌（圖1），在伊紅美蘭培養(yǎng)基培養(yǎng)后可觀察到金屬光澤菌落（圖2）。

圖1 腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)后鏡檢圖片

圖2 伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基

3.2 生化鑒定結(jié)果

按照生化鑒定說明書操作得到1 株大腸桿菌致病分離株，生化鑒定結(jié)果見表3。

表3 分離菌腸桿菌生化鑒定結(jié)果

3.3 大腸桿菌16sRNA鑒定結(jié)果

腸系膜淋巴結(jié)中4 株大腸桿菌致病分離株均可擴(kuò)增出1 540 bp大小的目的條帶。PCR鑒定結(jié)果見圖3。

圖3 大腸桿菌16SrRNA的PCR電泳圖

3.4 大腸桿菌毒力基因PCR檢測結(jié)果

腸系膜淋巴結(jié)中1 株大腸桿菌致病分離株檢測到K99、Sta、irp2、Eae基因分別在163 bp、314 bp、301 bp、552 bp處有清晰條帶，與預(yù)期目的片段大小相符（圖4）。

圖4 分離株毒力基因PCR檢測結(jié)果

3.5 大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

腸系膜淋巴結(jié)中4 株大腸桿菌致病分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

不管是奶牛場還是肉牛場，犢牛是牧場發(fā)展的基礎(chǔ)。而消化道疾病是新生犢牛極易發(fā)生的疾病，飼養(yǎng)不當(dāng)，環(huán)境中攜帶致病菌，犢牛應(yīng)激導(dǎo)致個體免疫力下降從而發(fā)病。應(yīng)激包括冷熱應(yīng)激等。夏季防暑、冬季保暖，落實(shí)新生犢牛初乳飼喂，加強(qiáng)牧場飼養(yǎng)管理，避免犢牛腹瀉給牧場帶來不必要的損失[3，6，7]。本試驗(yàn)查明該規(guī)模化牧場犢牛腹瀉的主要因素是大腸桿菌。

大腸桿菌作為環(huán)境中的常見菌，其主要致病性由其本身的毒力基因來決定。通常采用PCR根據(jù)其毒力基因進(jìn)行分型，其中ETEC主要檢測的毒力基因?yàn)镵99[8～10]，本試驗(yàn)中的4 株致病菌檢測出具有K99基因、Sta基因、irp2基因、Eae基因。

通常大腸桿菌引起的犢牛腹瀉使用抗生素治療為主，為了避免細(xì)菌的耐藥性，嚴(yán)禁大劑量使用致病菌株不敏感的抗生素，而應(yīng)使用大腸桿菌高度敏感藥物，科學(xué)合理地使用抗生素，常用藥物有慶大霉素、土霉素等[3，11]。該病要以預(yù)防為主，發(fā)病時對因治療[3，12～15]。

本試驗(yàn)結(jié)果為腸系膜淋巴結(jié)中4 株大腸桿菌致病分離株對頭孢曲松、恩諾沙星高度敏感，對鏈霉素、頭孢哌酮、慶大霉素敏感，建議牧場對發(fā)病嚴(yán)重犢牛采用生物灌服慶大霉素，并注射恩諾沙星聯(lián)合治療，脫水犢牛及時補(bǔ)液。對腹瀉癥狀有所好轉(zhuǎn)的犢牛采用巴殺牛奶中加入黃芪多糖及乳酸菌，提高犢牛抵抗力，治療效果十分顯著。