血漿miR-146a-5p在2型糖尿病臨床診斷中的應(yīng)用效果

孫雅楠 尹明潔 米穎 李斯

【摘要】? 目的? 檢測血漿中microRNA-146a-5p（miR-146a-5p）在2型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM） 患者及健康人群血漿中的表達水平，分析miR-146a-5p對T2DM的診斷價值。方法? 選取2017年1月至2019年6月醫(yī)院診斷為T2DM患者47例為病例組（T2DM組）；健康人員28例為對照組。抽取患者靜脈血，提取miRNA，應(yīng)用實時熒光定量PCR法以miR-423-5p為內(nèi)參照物進行校正，檢測兩組血漿中miR-146a-5p表達水平；應(yīng)用ROC曲線分析血漿中的miR-146a-5p對T2DM診斷效能并篩選診斷界值，評價診斷結(jié)果的真實性和一致性。結(jié)果? 與對照組相比，T2DM組患者血漿miR-146a-5p表達水平明顯下降（P<0.001）；ROC分析顯示，AUC=0.951（95%CI：0.907～0.995），表明血漿miR-146a-5p對T2DM具有較高診斷效能。以血漿miR-146a-5p表達水平（2-?CT轉(zhuǎn)換后）<0.437為診斷T2DM的標準，診斷結(jié)果顯示，靈敏度=87.234%，特異度=96.429%，具有較高的真實性，并且Kappa=0.808，診斷結(jié)果與實際結(jié)果高度一致，具有臨床應(yīng)用價值。結(jié)論? T2DM患者血漿miR-146a-5p表達水平顯著降低，血漿miR-146a-5p對T2DM的診斷有較高真實性及一致性。

【關(guān)鍵詞】? microRNA-146a-5p；2型糖尿病；實時熒光定量PCR；ROC曲線

中圖分類號? R587.1;R44? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）03--03

大量研究顯示，2型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM ）患者循環(huán)系統(tǒng)中常伴有炎性因子表達水平升高[1-3]，提示患者高血糖可能與體內(nèi)的慢性低度炎癥反應(yīng)有關(guān)。miR-146a-5p基因位于人類染色體的第5號，最初認為其具有免疫調(diào)節(jié)功能的microRNA。國內(nèi)外曾有學(xué)者報道，在糖尿病發(fā)生過程中患者胰島細胞內(nèi)及血細胞內(nèi)miR-146a-5p表達水平顯著下降[4-5]，但關(guān)于T2DM患者血漿中miR-146a-5p表達水平的研究較少。本研究通過檢測T2DM患者血漿中miR-146a-5p的表達水平，探討血漿miR-146a-5p在T2DM診療中的應(yīng)用價值。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

選取2017年1月至2019年6月醫(yī)院科室收治新診斷為T2DM的47例患者為病例組（T2DM組），同期選擇年齡及性別與T2DM組相匹配的，健康人員28例為對照組。T2DM診斷標準：口服75g葡萄糖耐量試驗：如空腹靜脈血糖≥7.0mmol/L，糖負荷后2小時靜脈血糖 ≥11.1mmol/L即可確診。患者納入標準為：①符合1999年WHO診斷標準的T2DM患者；②體質(zhì)量指數(shù)（BMI）在18.5～28.0；③無皮質(zhì)醇增多癥、甲狀腺功能異常等影響糖代謝的疾病。排除標準：①1型糖尿病的患者；②C肽水平顯著降低的患者；③肝功能異常：ALT≥正常值上限的2.5倍；④腎功能不全：血清肌酐大于正常值；⑤合并冠心病、腦血管疾病等T2DM血管并發(fā)癥患者，及近期出現(xiàn)糖尿病酮癥等急性并發(fā)癥的患者；⑥近期存在重度感染、有手術(shù)、外傷等應(yīng)激狀態(tài)者；⑦有嚴重的其他系統(tǒng)疾病如消化、呼吸、神經(jīng)、免疫等以及惡性腫瘤病史；⑧妊娠期以及哺乳期的患者；⑨拒絕提供知情同意的受試者。本研究由醫(yī)院倫理委員會審核后批準，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2? 實驗室檢測方法

（1）標本的采集：早晨8點空腹狀態(tài)下靜脈采血。

（2）血漿中總RNA的提取：本實驗使用mirVana Paris Kit的試劑盒，分離血漿后，提取血漿中的RNA，置于-80℃冰箱凍存，具體按照說明書步驟操作。

（3）cDNA的合成：應(yīng)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR），Taqman探針方法，于冰浴完成，包括：10×buffer 0.8μl、dNTP 0.2μl、抑制劑0.1μl、RNA 4.5μl、RNase-free水 0.4μl、RNA 引物1.5μl、RTase 0.5μl，RT-PCR反應(yīng)體系為8μl。反應(yīng)條件設(shè)定為：16℃孵育60 分鐘、42℃進行孵育60 分鐘、85℃孵育5 分鐘、4℃持續(xù)。

（4）qRT-PCR反應(yīng)體系的配置，反應(yīng)體系：2×Taq MAN universal PCR 反應(yīng)Master 混合物10μl；cDNA 4μl；RNase-free水5μl；TaqMAN probe 1μl，體系的總量為20μl。設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃10分鐘起始模板進行預(yù)變性，95℃15 秒中模板進行變性、60℃ 60 秒退火循環(huán)達40次；每個樣本均進行副管組，各組重復(fù)3次，記錄實驗的CT值并進行計算取平均值，數(shù)據(jù)后經(jīng)過2-?CT轉(zhuǎn)換之后進行統(tǒng)計學(xué)的比較分析。

1.3? 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，采用GraphPAD Prism 5.0軟件制圖。計數(shù)資料計算百分率，組間率的比較應(yīng)用卡方檢驗；正態(tài)分布的計量資料用“±s”表示，組間均數(shù)比較進行獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以“M（P25，P75）”表示，組間中位數(shù)比較用Kruskal-Wallis秩和檢驗；應(yīng)用ROC曲線分析血漿miR-146a-5p對2型糖尿病的診斷效能，并篩選臨界值。計算靈敏度和特異度，評價診斷結(jié)果的真實性；計算Kappa值評價診斷結(jié)果與實際結(jié)果的一致性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 兩組研究對象的基本特征比較

兩組男女構(gòu)成、年齡、BMI指數(shù)、血膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組間清晨空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血紅蛋白，T2DM組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2? 兩組血漿中miR-146a-5p表達水平比較

T2DM組血漿miR-146a-5p表達水平（2-?CT轉(zhuǎn)換后）為0.016（0.006，0.093），對照組為0.848（0.586，1.050），T2DM組的表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（秩和檢驗χ2=42.192，P=0.000）。

2.3? 血漿miR-146a-5p對2型糖尿病的診斷效能

以健康人群為對照組，ROC分析顯示其AUC=0.951（95%CI：0.907～0.995），表明血漿miR-146a-5p對T2DM具有較高的診斷效能，根據(jù)約登指數(shù)最大篩選臨界值為0.437。見圖1。

2.4? 血漿miR-146a-5p用于T2DM的診斷結(jié)果

以血漿miR-146a-5p表達水平（2-?CT轉(zhuǎn)換后）< 0.437為診斷T2DM的標準，診斷結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，血漿miR-146a-5p診斷T2DM靈敏度87.234%，特異度96.429%，具有較高的真實性，并且Kappa值為0.808，診斷結(jié)果與實際結(jié)果高度一致，具有臨床應(yīng)用價值。

3? 討論

miRNA是一類非編碼單鏈小RNA分子，能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)多種蛋白的表達，miRNA廣泛存在于機體細胞內(nèi)及循環(huán)系統(tǒng)中。在機體處于相對的穩(wěn)定狀態(tài)時，人體組織細胞內(nèi)以及人體各種循環(huán)系統(tǒng)中miRNA的表達量維持穩(wěn)定，但是，如果人體處于應(yīng)激或各種疾病的狀態(tài)下，miRNA分子，會根據(jù)各種功能作用從組織細胞中大量的釋放到外周血或體液中發(fā)揮固定的作用[6]，也有一部分是通過血液系統(tǒng)進行傳遞，到達受體細胞進一步發(fā)揮作用。這種作用機制使得血漿中miRNA的表達量會根據(jù)機體不同狀態(tài)發(fā)生變化，并且血漿中miRNA的變化常早于蛋白類的標記物[7]，以上特點使血漿miRNA具有成為全新疾病檢測標記物的潛能。

miR-146a-5p在T2DM中的研究顯示，T2DM患者外周血單個核細胞中表達水平顯著低于正常對照組[4]。在T2DM大血管并發(fā)癥患者血漿中miR-146a-5p表達水平顯著降低[8]。成人糖尿病患者，當合并缺血性腦血管疾病發(fā)現(xiàn)其血漿miR-146a-5p分子水平較單純糖尿病患者降低，機制可能是發(fā)生了級聯(lián)誘導(dǎo)的血小板激活，中國糖尿病患者中有的學(xué)者將血漿miR-146a-5p表達水平降低，定義為缺血性腦血管病的預(yù)測之一[9]。而目前國內(nèi)外關(guān)于T2DM患者血漿中miR-146a-5p表達水平以及血漿miR-146a-5p對T2DM診斷價值的研究尚未見報道，本研究通過檢測T2DM組與對照組血漿miR-146a-5p并進行比較，提示T2DM組患者血漿中miR-146a-5p水平是顯著下降的，進一步通過ROC曲線分析血漿miR-146a-5p對于T2DM診斷價值，ROC分析顯示其AUC=0.951（95%CI：0.907～0.995），表明血漿miR-146a-5p對T2DM具有較高的診斷效能，通過約登指數(shù)計算出其臨界值為0.437，敏感度為0.946，特異度為0.872。進一步以血漿miR-146a-5p水平<0.437為診斷T2DM的標準顯示，血漿miR-146a-5p診斷T2DM靈敏度87.234%，特異度96.429%，具有較高的真實性，并且Kappa值為0.808，診斷結(jié)果與實際結(jié)果高度一致，具有臨床應(yīng)用價值。以上結(jié)果說明，血漿miR-146a-5p可能是T2DM診斷的潛在標記物。

本實驗通過檢測T2DM患者血漿miR-146a-5p表達水平，證實血漿miR-146a-5p在T2DM發(fā)展過程中表達水平會發(fā)生顯著變化，并對T2DM具有較高診斷價值。

4? 參考文獻

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[2022-12-13收稿]