西紅康對2型糖尿病腎病大鼠腎足細胞功能的影響

玉山江 ·艾克木，哈麗達·木沙，王曉騰，鄭 靜

(1.新疆醫科大學附屬中醫醫院干一科，新疆 烏魯木齊 830054; 2.新疆醫科大學第一附屬醫院干部綜合科，新疆 烏魯木齊 830011)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是導致終末期腎功能衰竭的主要原因之一，白蛋白尿是評估DN進展的重要指標之一[1]。而研究發現腎足細胞超微結構的改變及其相關分子表達的變化在DN的發生與發展過程中發揮重要的作用，主要表現為腎足細胞的數量減少，且合并腎足細胞代償性的肥大與足突胞體增寬，從而導致腎小球濾過屏障的通透性增加引發蛋白尿[2-3]。西紅康具有益氣養陰、滋補肝腎與活血化瘀的功效。前期的研究證實其可有效減少DN患者微量白蛋白排出，達到良好的治療效果并顯著提高患者生活質量[4]。本研究擬通過動物實驗探討西紅康對2型糖尿病腎病腎臟足細胞結構的影響，從病理學角度探究西紅康保護腎臟、降低尿蛋白的作用機制，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF級8周齡雄性Wistar大鼠50只，體重200～220 g，全部飼養自我院實驗動物中心。晚期氧化蛋白產物(Advanced oxidationprotein products，AOPPs)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒、鏈脲佐菌素(STZ)與微量尿白蛋白測定試劑盒購自美國 Sigma 公司；固定試劑(3%戊二醛、1%鋨酸)與脫水劑(50%、70%、90%的乙醇，90%的丙醇，90%的乙醇∶90%的丙酮=1∶1 混合液)購自南京建成生物工程研究所。包埋劑(Epon812 環氧樹脂)；光影染色液(0.5%的甲苯胺藍)與電子染色劑(醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛)購自中生北控生物科技股份有限公司。西紅康購自我院中藥房，并將其熬制成中藥湯劑，塑料無菌包裝。

1.2 分組及模型建立 將50只SPF級8周齡雄性Wistar大鼠分為空白對照組(n=10)和 DN模型組(n=40)，測量記錄每只大鼠的初始體重。給予空白對照組大鼠普通飼料喂養，而DN模型組則予以高脂高糖飲食喂養。喂養8周后，DN模型組以小劑量STZ(15～25 mg/kg)腹腔注射誘導2型糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功)，而空白對照組大鼠給予等體積0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液注射。將造模成功的DN大鼠隨機平均分為四組：模型對照組(n=10)、西紅康小劑量組(n=10)、西紅康中劑量組(n=10)與西紅康大劑量組(n=10)，給予各組大鼠普通飼料喂養外，西紅康小、中、大劑量治療組分別給予西紅康3、6、12 g/(kg·d) 湯劑灌腸，空白對照組和模型對照組每日給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌腸，共飼養30 d。

1.3 動物取材及指標測定 干預結束后，大鼠剪尾取靜脈血，用血糖儀測空腹血糖(FBG)水平，在根據AOPPs ELISA試劑盒說明書，按順序加入標本、標準樣、帶有辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，然后溫育并且徹底地洗滌，顯色后應用酶標儀在吸收波長為450 nm波長下測定其吸光度，即可以計算出樣品AOPPs的濃度；收集12 h夜尿后嚴格按照微量尿白蛋白測定試劑盒說明書操作，根據其濁度結果得出樣品中尿微量白蛋白(Microalbumin，mALB)水平。大鼠禁食12 h后，麻醉狀態下解剖取出腎臟，取一部分腎皮質組織放于甲醛固定液中保存，標上編號送檢。經脫水、滲透、包埋后切片，染色于電鏡下觀察。觀察足細胞計數、足突平均寬度(FPW)及足突融合率、腎小球基底膜平均厚度(GBM)平均厚度，具體如下：①足細胞計數：每例至少觀察3個腎小球，隨機選取10個視野，計數足細胞個數。②足突寬度：測定足突兩側膜間的距離在裂化膜水平上，算出其平均值。③足突融合率：首先量出GBM總長度，標為X，然后量出 GBM 上足突合的總長度，設為Y，再用Y除以X，即為融合率。④GBM：將GBM 分成若干個點，然后在每點GBM測定其厚度，再相加各點服M的厚度設為X，其測定的點數設為Y，最后用X除以Y，即為各組GBM的平均厚度。

1.4 統計學方法 應用SPSS 24.0統計學軟件對數據進行分析。計數資料采用卡方檢驗和Fisher精確檢驗；計量資料用均數±標準差表示并采用獨立樣本t檢驗；P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 空白對照組與DN模型組各項生化指標比較 DN模型組體重、FBG、FINS、HOMR-IR、TG、TC、mALB與AOPPs水平較空白對照組均明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 空白對照組與DN模型組各項生化指標比較

2.2 不同劑量西紅康對大鼠FBG、mALB與AOPPs水平的影響 干預治療30 d后，各劑量西紅康治療組與模型對照組比較，FBG、mALB與AOPPs水平均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，但各劑量治療組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同劑量西紅康對大鼠FBG、mALB與AOPPs水平的影響

2.3 不同劑量西紅康對大鼠腎足細胞超微結構的影響 干預治療30 d后，各劑量西紅康治療組與模型對照組比較，足細胞計數、足突寬度、足突融合率與GBM均明顯增高或降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；西紅康大劑量組、西紅康中劑量組與西紅康小劑量組比較，足細胞計數、足突寬度、足突融合率、GBM差異均具有統計學意義(P<0.05)。隨著西紅康劑量的增加，大鼠腎小球GBM增厚、足突斷裂、排列不整齊與足突融合(如圖1中箭頭所示)等現象明顯減輕。見表3。

表3 不同劑量西紅康對大鼠腎足細胞超微結構的影響

圖1 不同劑量西紅康對大鼠腎足細胞超微結構的影響(熒光染色，×400)

3 討 論

DN患者腎活檢中早期特征性的病理變化是腎小球病變，主要病變為彌漫性腎小球硬化、結節性腎小球硬化和腎小球基底膜增厚[5]。彌漫性腎小球硬化是光鏡下最早可觀察到的病理變化，而隨著DN病程的進展，彌漫性腎小球硬化逐漸發展為結節性腎小球硬化，而結節性病變也稱為 Kimmelstiel-Wilson 結節，可在約25%的晚期DN患者中觀察到[6]。彌漫性腎小球硬化與結節性腎小球硬化實際上是DN的兩個階段，與彌漫性腎小球硬化比較，已發展到結節性腎小球硬化的DN患者的腎功能損害更嚴重，且病程也更長，預后更差[7]。雖然腎小球病變一直是DN研究的重點，但最新的研究發現腎小球外病變也對疾病的發生與進展有重要的影響，腎小管間質病變包括腎小管萎縮、間質性炎癥和腎小管間質纖維化，同樣與腎功能損害密切相關[8-9]。DN是一種糖尿病性微血管病，因此腎小球入小動脈和腎小球出小動脈也會發生玻璃樣變，而腎小球出小動脈玻璃樣變也是DN與高血壓腎病的鑒別要點[10-11]。實際上腎小球內皮細胞損傷、足細胞損傷等異常病變也和DN的發生與發展密切相關[12-13]。

本研究的結果發現不同劑量西紅康干預后，大鼠AOPPs和尿微量白蛋白水平較前均明顯減少組，但是西紅康大劑量組、西紅康中劑量組對大鼠腎小球GBM增厚、足突斷裂、排列不整齊、足突融合等現象的改善作用明顯優于西紅康小劑量組，這說明西紅康可減少尿白蛋白，改善腎功能，對DN的防治有重要的意義。目前臨床上西醫治療老年糖尿病腎病短期療效肯定，但長期治療效果不明確[14]。西紅康具備益氣養陰與補腎活血的作用，不僅可有效調節血糖與血壓，同時還可提高免疫力，對人體的血液循環系統、代謝系統與內分泌系統等均具有良好的調理作用[15]。當DN患者的腎臟足細胞密度和總數因受損傷凋亡、脫落減少，殘留的足細胞足突會發生代償性的增寬、融合與肥大，這會導致腎小球通透性增加，進而發生彌漫性腎小球硬化與結節性腎小球硬化[16-18]。蛋白尿的發生和足突融合、足突間隙增寬密切相關，而蛋白尿又會導致足細胞損傷，形成惡性循環，腎足細胞發生損傷后會發生足突融合、消失，胞體縮小及濾過屏障電荷減少，甚至形成假囊，最終導致足細胞凋亡、脫落以及腎小球濾過屏障的結構和功能變化[19-20]。

綜上所述，西紅康可降低2型糖尿病腎病大鼠的FBG、AOPPs與mALB水平，還可有效改善其腎足細胞超微結構，達到保護腎臟的作用。