活血化瘀祛痰法對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管重構的影響

郭曉燕，畢蓉蓉，張曄敏，陸城華

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032)

肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是以肺血管阻力和肺動脈壓持續性升高為特征的慢性肺血管疾病，以肺血管內皮功能障礙、平滑肌增殖、纖維化和原位血栓形成為特征，最終導致右心功能不全，甚至死亡，PH是多種并發癥的產生的誘因，也是多種疾病發展到一定階段后出現的病理性變化[1]。其發病機制復雜，治療困難，預后差，嚴重程度甚至遠遠超過了癌癥。據估計，與任何病因的PH相關的病死率為女性5.5/10萬，男性5.6/10萬，從診斷PH起平均存活時間為2～5年[2]。目前臨床治療PH藥物包括肺血管擴張劑、內皮素抑制劑、NO激活劑等靶向藥物，血管擴張劑可改善患者臨床癥狀，未能有效降低患者病死率。靶向藥物能夠改善患者生存質量，遠期療效欠佳[3-4]，PH的1年病死率仍然高達15%[5]。PH病理特征是肺血管重構，表現在肺動脈血管內皮損傷、血管中膜增厚等，肺血管腔狹窄、管壁增生甚至血管閉塞，最終引起肺動脈壓力增高[6-7]。因此，阻止及逆轉肺血管結構重建是治療PH的關鍵環節。既往研究顯示，中藥復方制劑可能通過調節血管舒張功能、保護肺血管內皮功能、抑制肺動脈平滑肌細胞增殖、抑制肺血管重構等機制以改善PH患者肺動脈壓力、右心功能等[8-9]。PH屬于中醫“肺脹”“喘證”等范疇，早期病變首先在肺，早期以痰濁為主，漸而痰瘀互見，終至痰濁、血瘀等錯雜為患。吳瑩等[10]研究發現痰濁、瘀血是PH病情發展過程中的病理產物和致病因素，活血化瘀祛痰是治療PH的重要原則。本文基于前期研究，擬采用活血化瘀祛痰法治療PH，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康SD大鼠，SPF級，體重(200±20) g，飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院動物房。動物許可證號SYXK(滬)2018-0036，環境溫度(25±1)℃，濕度28%中適應性飼養1周后進行實驗。

1.1.2 實驗藥物：①中藥復方由川芎、赤芍、白芍、當歸、丹參、黃荊子等組成，取上述藥物制成液體制劑，其濃度為每毫升含生藥量1.526 g，由上海中醫藥大學附屬龍華醫院制劑室提供。根據成人日服劑量，按動物體表面積比率換算等效劑量，日服量：8.64 g/(kg·d)。②鹽酸法舒地爾注射液：規格2 ml:30 mg/支(天津紅日藥業有限公司)。

1.1.3 主要實驗試劑與儀器：多道生理信號采集系統(成都儀器廠)；電泳儀(BIO-RAD公司)；轉膜儀(BIO-RAD公司)；酶標儀(Thermo公司)；DMEM/F-12(Gibco)；抗生素(青鏈霉素)(Gibco)；FBS(Gibco)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶(Gibco)；超低溫冰箱(Haier)；倒置顯微鏡(Olympus)；超凈工作臺(Baker公司)；Marker(Thermo公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備：采用野百合堿(MCT)腹腔注射建立肺動脈高壓模型。大鼠腹腔內一次性注射MCT50 mg/kg，觀察3周。

1.2.2 分組與給藥：SD大鼠按隨機數字表法隨機分為四組，分別為假手術組、模型組、中藥復方組、法舒地爾組，每組15只。各組均從第1天起開始給藥，中藥復方組給予中藥 8.64 g/(kg·d)灌胃，法舒地爾組給予鹽酸法舒地爾注射液15 mg/(kg·d)腹腔注射，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日1次，持續3周。

1.2.3 取材與處理：脫臼法處死大鼠后取出肺臟，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后剪取右外上肺葉，浸泡于4% 多聚甲醛緩沖液固定，制備肺組織病理標本。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般狀態：觀察各組大鼠一般狀態、體重、呼吸、活動狀態。

1.3.2 肺動脈壓：采用大鼠行右心導管術測定大鼠肺動脈壓[11]，將大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，頸部正中作長約1.5 cm的縱行切口，并游離右頸外經脈約1 cm，結扎，剪口，用一充盈肝素溶液的聚乙烯管經頸靜脈緩慢插管至右心房、右心室及肺動脈，導管另一端連接壓力傳感器到生物信號采集系統，根據壓力波形確定測導管位置，記錄平均肺動脈壓力(mPAP)。

1.3.3 右心指數：測定肺動脈壓力結束后，立即完整取出心臟和肺臟，分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+S)，并依次稱重，計算右心肥大指數(RVHI)=RV/(LV+S)。

1.3.4 肺組織病理：大鼠右肺中葉組織4%多聚甲醛固定24 h，行HE染色觀測模型肺組織的病理改變、維多利亞藍+VG特殊染色觀察肺血管重建指標。采用Image J圖像分析軟件測量血管內徑(D1)、外徑(D2)，計算肺動脈血管壁厚度百分比(WT%)，WT%=(D2-D1)/D2×100%。

1.3.5 ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達：采用Western blot法檢測。常規提取組織蛋白,使用考馬斯亮藍法進行蛋白定量,SDS-PAGE 電泳、轉膜,一抗結合和二抗結合[一抗為鼠抗Rho 抗體(Thr696,1∶1500)、兔抗ROCK 抗體(1∶1000)抗體和兔抗DAPDH 抗體;二抗為生物素標記的山羊抗小鼠IgG 或者山羊抗兔IgG (1∶800稀釋)],曝光、顯影、定影。以GAPDH 為內參照,應用圖像分析軟件進行條帶掃描分析,目的蛋白顯色條帶灰度與GAPDH 顯色條帶灰度比值代表目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行統計。數據以均數±標準差表示，對數據進行正態分布檢驗，符合正態分布者采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，不符合正態分布者，采用非參數檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀態及體重比較 注射MCT4周后大鼠一般情況發生變化，動物活動能力下降，毛發晦暗、缺少光澤，呼吸急促加快，易激惹，食欲下降，逐漸消瘦。模型組、中藥復方組、法舒地爾組均已出現明顯體重下降、呼吸急促等表現。結果顯示，模型組較假手術組體重明顯降低(P<0.01)，中藥復方組、法舒地爾組體重較模型組升高(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠肺動脈壓力比較 模型組mPAP明顯高于假手術組(P<0.01)，中藥復方組、法舒地爾組mPAP均低于模型組(P<0.01)，法舒地爾組與中藥復方組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠右心指數比較 模型組RVHI均明顯高于假手術組(P<0.05)，中藥復方組、法舒地爾組大鼠右心指數均低于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體重、右心指數、mPAP比較

2.4 各組大鼠肺血管重構比較 假手術組大鼠肺泡完整，肺小動脈血管壁光滑無增厚，管腔無狹窄，血管內皮細胞分布均勻，連續性完整；模型組大鼠肺中動脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄，中層平滑肌細胞增殖肥大、排列紊亂。模型組肺中動脈管腔狹窄、中膜增厚程度較對照組明顯(P<0.01)，中藥復方組、法舒地爾組血管增殖程度較模型組減輕(P<0.01)。見圖1、2。

圖1 各組大鼠肺動脈血管病理變化(HE染色，×400)

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖2 各組大鼠血管壁厚度百分比比較

2.5 各組大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ表達水平比較 與假手術組比較，模型組ROCKⅠ、ROCKⅡ水平均較假手術組明顯升高(P<0.05或P<0.01)；中藥復方組、法舒地爾組ROCKⅠ、ROCKⅡ水平低于模型組(P<0.05或P<0.01)；中藥復方組ROCKⅠ、ROCKⅡ水平與法舒地爾組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖3 各組大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白水平表達比較

3 討 論

PH患者肺動脈內皮細胞功能失調、PASMCs增生、肺血管收縮和原位血栓形成，導致組織缺氧，血液黏滯度增加，肺絡瘀阻，呈現局部瘀血阻滯狀態。徐欣等[12]基于文獻研究顯示，PH中醫證候主要為肺腎氣虛證、痰瘀阻肺證。翟佳濱等[13]認為氣滯、痰阻、血瘀為本病的主要病理產物。從上述研究看出，PH屬于本虛標實之病，痰瘀阻肺是其標，正氣虧虛是其本證型，活血化瘀祛痰是其主要治療原則。本研究方藥由川芎、赤芍、丹參、當歸、白芍等組成，具有活血化瘀、化痰止咳平喘等作用?，F代研究顯示，川芎有效成分川芎嗪具有保護血管內皮損傷、抑制血管平滑肌細胞增殖與遷移等作用[14-15]。丹參酮ⅡA對PH的保護主要通過抑制肺血管異常收縮、肺血管重構，改善肺部血管炎癥反應，改善右心室功能等發揮作用；芍藥苷具有抗凝血、擴血管作用[16]；當歸提取物當歸注射液可抑制肺小動脈管壁增厚，降低肺血管壓力[17]。MCT在體內經肝臟代謝成為有生物活性的脫氫野百合堿，選擇性地引起肺動脈內皮細胞損傷和凋亡，促進內源性NO的合成分泌降低，縮血管物質釋放增加，導致肺動脈持續收縮，誘導肺動脈血管重構，導致PH[18]。MCT誘導的PH模型可見明顯血管內皮細胞損傷、肺動脈血管平滑肌細胞增殖、動脈管壁明顯增厚，肺血管重構[19]。本研究顯示,經MCT腹腔注射誘導后，模型組大鼠動物活動量減少，呼吸急促加快、煩躁，食欲下降，體重減輕，肺動脈壓力、右心指數均較假手術明顯升高，肺血管WT比例較假手術組增加，中藥復方組、法舒地爾組均較模型組大鼠體重升高，肺動脈壓力、右心指數下降，肺血管WT比例降低，表明中藥復方能夠降低MCT誘導的PH，減輕右心負荷，抑制肺動脈血管的增殖。導致肺動脈高壓血管重構的機制有K+離子通道、Rho激酶信號通路、BMP信號通路等[20]，其中Rho激酶相關通路在肺血管重構中具有重要作用，Rho激酶存在兩種同源性極高的異構體形式 (Rokα/ROCKⅠ 和Rokβ/ROCKⅡ)，激活的Rho 激酶可對其底物肌球蛋白磷酸酶進行磷酸化修飾，引起細胞骨架重組，促進血管平滑肌收縮，平滑肌細胞的遷移、增殖，導致肺動脈高壓血管重構[21]。Rho激酶信號介導PASMC和EC中的細胞骨架重排，Rho激酶(ROCK)信號通路在介導所有PH模型中的血管收縮中起核心作用，Rho激酶抑制劑能防治MCT誘導的和基因易感型的大鼠PH，從而改善內皮依賴性的血管舒張，抑制肺動脈平滑肌細胞增殖并促進其凋亡，促進肺血管收縮和肺血管結構重建，參與PH的發病過程。本研究顯示，MCT誘導后，與假手術組比較，模型組ROCKⅠ、ROCKⅡ表達明顯增加，給藥后中藥復方組、法舒地爾組ROCKⅠ、ROCKⅡ表達水平較模型組明顯下降，中藥復方組與法舒地爾組比較，差異無統計學意義，表明活血化瘀祛痰法可以抑制Rho激酶信號通路的激活，抑制PH血管重構。