Folin-Ciocalteu比色法測定澳洲堅果青皮中多酚含量

趙紅，馬尚玄，鐘濤，徐榮，付鎵榕

云南省熱帶作物科學研究所（景洪 666100）

澳洲堅果（Macadamia spp.）又稱夏威夷果，屬山龍眼科（Proteaceae），澳洲堅果屬（Macadamia F.Muell）常綠喬木果樹[1-2]。澳洲堅果主要種植在澳大利亞、中國、美國等30余個國家和地區，我國種植區域主要分布在云南、廣西、貴州等省區[3-4]。澳洲堅果富含不飽和脂肪酸、蛋白質、碳水化合物以及鈣、磷、鐵、B族維生素、抗糙皮病的煙酸和酚類物質等，具有豐富的藥用保健價值[5-9]。其中，從澳洲堅果中提取的酚類物質是天然的抗氧化劑，對澳洲堅果果仁防止氧化起一定保護作用，并具有抑菌、助消化、降血脂、抗輻射、抗腫瘤等多種功能[10-12]。隨著澳洲堅果附屬產品的開發，對澳洲堅果中的酚類物質進行深入研究有利于提高澳洲堅果的附加值。

多酚含量的測定方法有酒石酸亞鐵法、高錳酸鉀滴定法、Folin-Ciocalteu比色法、普魯士藍法及氣相、液相色譜法等[13-15]。Folin-Ciocalteu比色法具有操作便捷、成本低廉、準確度高等優點，常用于植物體內的多酚化合物的測定[16-19]。試驗采用Folin-Ciocalteu比色法測定澳洲堅果中多酚成分含量，對反應時間、反應溫度、Na2CO3濃度、試劑用量等測定條件進行優化，并對該法的穩定性、精密度、重現性等進行試驗評價，旨在建立測定澳洲堅果中多酚含量的方法，為澳洲堅果產品的開發和利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲堅果青皮樣品：澳洲堅果采摘于云南省景洪市景哈鄉云南省熱帶作物科學研究所澳洲堅果試驗基地，清洗后脫下青皮，放置恒溫干燥箱中45 ℃烘至恒重，粉碎過篩，取0.9～2.0 mm的青皮粉與0.9 mm以下的青皮粉按1∶1混合，備用。

沒食子酸標準品（中國藥品生物制品檢定所）；Folin-Ciocaileu試劑（合肥博美生物科技有限責任公司）；無水乙醇、Na2CO3等（國藥集團，分析純）。

1.2 儀器與設備

BGZ-240型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；ME204E型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV-1100型紫外-可見分光光度計（上海美譜達有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

1.3 方法

1.3.1 澳洲堅果青皮多酚提取液的制備

準確稱取烘干后粉碎過篩的澳洲堅果青皮樣品50 g，用60%乙醇溶液按1∶30 g/mL滲漉提取，減壓蒸餾后定容至500 mL，取上1 mL清液定容至100 mL，備用。

1.3.2 標準品溶液的配制

準確稱取0.100 0 g沒食子酸標準品，用50 mL蒸餾水溶解，移至100 mL容量瓶中，定容搖勻，得質量濃度1.00 mg/mL的沒食子酸標準儲備液。分別移取2，3，4，5，6，7和8 mL標準儲備液到100 mL容量瓶中，加蒸餾水至標線定容，得質量濃度分別為20，30，40，50，60，70和80 μg/mL的系列標準溶液，備用。

1.3.3 Folin-Ciocalteu比色法測定條件的優化

1.3.3.1 檢測波長的確定

分別準確移取1.0 mL澳洲堅果青皮多酚提取液和1.0 mL 40 μg/mL的沒食子酸標準溶液到比色管中，分別加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 12.5%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30 ℃水浴條件下反應1 h，用紫外分光光度計在400～800 nm波長范圍內進行掃描，繪制光譜曲線，以確定最佳波長。

1.3.3.2 顯色時間的確定

準確移取1 mL沒食子酸標準溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 12.5%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30℃水浴條件下分別反應30，40，50，60，70，80和90 min后，取出測定吸光度，以確定最佳顯色時間。

1.3.3.3 Na2CO3濃度的確定

準確移取1 mL沒食子酸標準溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，分別加入3 mL 5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%，17.5%和20.0%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30 ℃水浴條件下反應1 h后，取出測定吸光度，以確定Na2CO3溶液的最佳濃度。

1.3.3.4 Na2CO3試劑加入量的確定

準確移取1 mL沒食子酸標準溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，分別加入1，2，3，4，5，6和7 mL的15% Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置在30 ℃水浴條件下反應1 h后，取出測定吸光度，以確定Na2CO3試劑的最佳用量。

1.3.3.5 顯色溫度的確定

準確移取1 mL沒食子酸標準溶液到比色管中，加入1 mL 1 mol/L的Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 15%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻分別靜置于20，30，40，50，60，70和80 ℃水浴反應1 h后，取出測定吸光度，以確定最佳顯色溫度。

1.3.3.6 Folin-Ciocalteu試劑用量的確定

準確移取1 mL沒食子酸標準溶液到比色管中，分別加入0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50和1.75 mL的1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，3 mL 15%的Na2CO3溶液后，加蒸餾水定容至10 mL，混勻靜置于40 ℃水浴鍋內，待其反應1 h后，取出測定吸光度，以確定Folin-Ciocalteu試劑最佳用量。

1.3.4 標準曲線的繪制

分別移取1 mL不同濃度的沒食子酸標準溶液，以蒸餾水替代樣品為空白，采用1.3.3小節的方法確定的最佳測定條件，以沒食子酸標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 Folin-Ciocalteu比色法的評價

1.3.5.1 穩定性試驗

取制備好的澳洲堅果青皮滲漉提取液，按照試驗確定的最佳測定條件，在與顯示劑反應完全后避光靜置0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 h后測定吸光度，根據吸光度的變化評價該比色法在一定時間內的穩定性。

1.3.5.2 重現性試驗

取5份澳洲堅果青皮樣品制備青皮滲漉提取液，按照試驗確定的最佳測定條件測定吸光度，并計算多酚含量和相對標準偏差，以評價該比色法的重現性。

1.3.5.3 精密度試驗

按照試驗確定的最佳測定條件，對同一澳洲堅果青皮滲漉提取液平行測定5次吸光度，計算相對標準偏差，以評價該比色法的精密度。

1.3.5.4 加標回收試驗

在6份澳洲堅果青皮滲漉提取液中分別加入0，10，20，30，40和50 μg的沒食子酸標準品，測定提取液中的多酚含量，并計算回收率、平均回收率和相對標準偏差，以評價該比色法的準確度和可靠性。

2 結果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu比色法檢測條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定

酚類物質與Folin-Ciocalteu試劑反應后，Folin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸被還原，使W6+變為W5+，生成藍色的化合物，通過在400～800 nm范圍內測定藍色化合物的吸收光譜，選出最大吸收波長為檢測波長[20-21]，不同波長下的檢測結果如圖1所示。

圖1 標準溶液和樣品溶液的吸收光譜

結果表明，沒食子酸標準溶液、澳洲堅果青皮提取液反應顯色后，兩者均在762 nm處有最大吸收，因此最佳檢測波長為762 nm。

2.1.2 顯色時間的確定

提取液中的酚類物質與加入的Folin-Ciocalteu試劑反應需要一定時間，不同反應時間對吸光度的影響如圖2所示。

圖2 吸光度隨顯色時間的變化

結果表明，吸光度在60 min內逐漸增大，顯色反應較快，在60 min處達到最大值，隨后吸光度趨于穩定，說明60 min時反應已基本完全，因此最佳顯色時間為60 min。

2.1.3 Na2CO3濃度的確定

Na2CO3溶液是顯色反應中的緩沖液，在提供堿性環境的條件下使酚類物質與顯色劑反應顯藍色，顯色反應對Na2CO3溶液的濃度有一定要求，濃度高低都會影響顯色體系的穩定性[22]，不同Na2CO3濃度對吸光度的影響如圖3所示。

圖3 吸光度隨Na2CO3濃度的變化

結果表明，隨著Na2CO3溶液濃度的增加，吸光度呈先上升后下降趨勢，Na2CO3溶液濃度15%時，吸光度達到最大值，因此Na2CO3最佳濃度為15%。

2.1.4 Na2CO3溶液加入量的確定

提取液在堿性的條件下才可以穩定顯色，Na2CO3加入量多少將影響提取液堿性的強弱，對提取液顯色有很大影響。不同加入量15% Na2CO3溶液對吸光度的影響如圖4所示。

圖4 吸光度隨Na2CO3溶液加入量的變化

結果表明，隨著15% Na2CO3溶液加入量的增加，吸光度總體呈先上升后下降趨勢，在用量3 mL時達到最大值，這可能是因為初始Na2CO3溶液加入量不足導致顯色不完全，而過量的Na2CO3溶液會影響顯色體系不穩定也會導致顯色不完全[23]。因此15% Na2CO3溶液最佳加入量為3 mL。

2.1.5 顯色溫度的確定

顯色溫度的高低會影響有色物質的穩定性和Na2CO3的溶解度，不同顯色溫度對吸光度的影響如圖5所示。

圖5 吸光度隨反應溫度的變化

結果表明，隨著溫度的升高，吸光度呈現先上升趨勢，在40 ℃時吸光度達到最大值，隨著反應溫度繼續升高，吸光度呈下降趨勢，這可能是隨著反應溫度的升高部分生成的有色物質被破壞分解所致[24]，因此最佳顯色溫度為40 ℃。

2.1.6 Folin-Ciocalteu試劑加入量的確定

Folin-Ciocalteu試劑與多酚反應后產生的物質對特定波長的光有最大吸收，所以Folin-Ciocalteu試劑加入量的多少決定著顯色反應是否完全[25]。不同Folin-Ciocalteu試劑加入量對吸光度的影響如圖6所示。

圖6 吸光度隨Folin-Ciocalteu試劑加入量的變化

結果表明，Folin-Ciocalteu試劑加入量在0.25～1 mL時，顯色劑增加吸光度也逐漸增加，加入量達到1 mL時，吸光度達到最大值，之后吸光度緩慢下降，因此Folin-Ciocalteu試劑最佳加入量為1 mL。

2.2 標準曲線的繪制

根據試驗方法制作標準曲線，以沒食子酸濃度為X軸、吸光度為Y軸建立的標準曲線如圖7所示。回歸方程式為y=0.012 3x+0.005 9，沒食子酸質量濃度在20～80 μg/mL范圍內與其吸光度呈現良好的線性關系（R2=0.999 0），該方程可用于澳洲堅果青皮中多酚的定量測定。

圖7 標準曲線

2.3 Folin-Ciocalteu法測定澳洲堅果青皮多酚方法學評價

2.3.1 穩定性試驗

取制備好的澳洲堅果青皮滲漉提取液，按照最佳測定條件進行穩定性試驗，在與顯示劑反應完全后避光放置在不同時間后取出測定吸光度見表1。隨著時間的延長，吸光度有緩慢上升趨勢，但幅度不大，相對偏差為2.05%，說明該方法在一定時間內穩定性較好。

表1 穩定性試驗

2.3.2 重現性試驗

取5份澳洲堅果青皮樣品制備青皮滲漉提取液，用Folin-Ciocalteu比色法測定其多酚含量進行重現性試驗，結果見表2。相對標準偏差為0.80%，說明該方法具有較好的重現性。

表2 重現性試驗

2.3.3 精密度試驗

根據最佳測定條件進行精密度試驗，對同一澳洲堅果青皮滲漉提取液平行測定5次吸光度，分別為0.504，0.492，0.496，0.495和0.493，相對標準偏差為0.96%。說明該方法具有較高的精密度，能滿足澳洲堅果青皮多酚的測定要求。

2.3.4 加標回收率試驗

在6份澳洲堅果青皮滲漉提取液中分別加入0，10，20，30，40和50 μg的沒食子酸標準品，由表3可知，加標回收試驗的最高回收率為102.40%，最低回收率為99.19%，平均回收率為100.65%，相對標準偏差為1.27%。說明完全可用于澳洲堅果青皮多酚的測定。

表3 加標回收率試驗

3 結論

澳洲堅果青皮中的酚類成分具有較好的抗氧化活性，在抗衰老、抗炎癥等方面可發揮作用[26-27]。試驗探究Folin-Ciocalteu比色法測定澳洲堅果青皮中的多酚含量，確定最優檢測條件：加入Folin-Ciocalteu試劑1 mL，15%的Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水定容至10 mL后置于40 ℃水浴鍋內，待其反應60 min后在762 nm波長處測定吸光度，沒食子酸質量濃度在20～80 μg/mL范圍內與吸光度呈現良好的線性關系（R2=0.999 0），平均回收率為100.65%，相對標準偏差為1.27%。結果表明該檢測方法操作過程簡單、便捷，重復性、穩定性好，精密度、回收率高，檢測結果準確可靠，可為澳洲堅果研究提供試驗參考。