燕麥配方對酪氨酸酶活性及黑色素抑制作用

木其爾，陳希民，陳月曉*

1.北京市營養源研究所（北京 100069）；2.北京市科學技術研究院（北京 100089）

隨著年齡增長，色素沉積、膚色暗黃等皮膚癥狀為東方女性追求美麗過程中越來越重視的問題。黑色素的代謝在膚色改善中發揮著重要作用[1]。目前曲酸[2]、維生素C[3-4]、亞油酸[5]等酸性成分是抑制黑色素形成的主要功效物質，但具有溶解性差、配伍性差及不穩定等缺點。而天然植物提取物，如洋甘菊提取物、甘草提取物、熊果苷[6-8]等，具有安全性高、刺激性小、療效顯著等優點，但易受使用劑量較小、皮膚屏障滲透吸收利用率低等因素的影響。

研究表明，燕麥中含有豐富的酚酸、類黃酮等化合物，具有較好的抗氧化功效[9-10]；燕麥生物堿提取物具有抗組胺和抗炎活性[11-12]，其美白功效研究卻鮮有報導。傳統中藥中具有美白功效的中藥材薏苡仁、茯苓、山藥、白蕓豆均被納入國家衛健委食品安全標準與檢測評估司發布的《按照傳統既是食品優勢中藥材的物質目錄管理規定》中。煙酰胺在臨床中具有抑制黑色素、加快皮膚細胞代謝以實現改善膚質的效果[13]。此次試驗選擇燕麥、椰粉、藥食同源原料及煙酰胺鋅作為品牌A即食麥片配方基礎，通過體外酪氨酸酶抑制實驗研究其對酪氨酸酶活性抑制的作用及黑色素抑制作用，并探索配方中燕麥、椰粉、煙酰胺鋅成分的酪氨酸酶活性抑制及黑色素抑制效果，為產品研發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

品牌A即食麥片（桂格5白混合即食麥片，主要原料包括燕麥、椰子粉、煙酰胺、藥食同源原料、鋅等）；燕麥片、椰子粉、煙酰胺鋅、燕麥椰子粉組合，均由百事亞洲研發中心有限公司提供。

蒸餾水（符合GB/T 6682—2016《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8，0.1 mol/L）；L-酪氨酸（分析純，T3754，純度＞98%，Sigma公司）；酪氨酸酶（T3824，1 000 U/mg，Sigma公司）；曲酸（S30151，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

ME235s電子天平（德國賽多利斯公司）；ML204T電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；DH-101-3BS電熱恒溫箱（天津市中環實驗電路有限公司）；KQ-500DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BioTek F4酶標儀（美國寶特公司）；-80 ℃超低溫冰箱（冠森生物科技上海公司）；96孔酶標板[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；NT-6L納米研磨機（無錫市少宏粉體科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

稱取0.025g L-酪氨酸，使用PBS緩沖液溶解，超聲助溶5 min，定容至50 mL，得到L-酪氨酸溶液。

稱取2.5 mg酪氨酸酶，用PBS溶液定容至5 mL，于-20 ℃保存。

稱取40 mg曲酸，用PBS溶液定容至1 L，制備成0.040 g/L曲酸標準溶液，用PBS溶液逐級梯度稀釋，最終制備成0.040，0.020，0.010，0.008，0.005和0.002 g/L標準溶液。

1.3.2 樣本處理

燕麥片、椰子粉、燕麥椰子粉組合、品牌A即食麥片分別使用納米研磨機研碎。

分別稱取70.71 mg燕麥片、9.3 mg椰子粉、79.45 mg燕麥椰子組合、100 mg品牌A即食麥片的研磨粉于10 mL容量瓶中，分別加入PBS溶液，37 ℃恒溫條件下超聲30 min，并定容至10 mL，轉移至15 mL離心管中，旋渦離心5 min，制備混懸液待測。

稱取0.05 mg煙酰胺鋅，溶于1 000 mL PBS溶液中，混勻待測。

0.025g L-酪氨酸，使用PBS緩沖液溶解，超聲助溶5 min，定容至50 mL，得到L-酪氨酸溶液。

1.3.3 試驗分組

在96孔酶標板中設置溶劑本底孔（編號Ta）、溶劑反應孔（編號Tb）、樣品本底孔（編號Tc）、樣品反應孔（編號Td）。其中：Ta組為溶劑本底組，不加底物L-酪氨酸溶液、不加樣品溶液；Tb組為溶劑反應組，加底物L-酪氨酸溶液但不加樣品溶液；Tc組為樣品本底組，不加底物L-酪氨酸溶液、加樣品溶液；Td組為樣品反應組，既加底物L-酪氨酸溶液又加樣品溶液。每組做3個平行。

1.3.4 試驗檢測

根據表1，在1.5 mL離心管中依次加入相應體積的PBS溶液、酪氨酸酶及5種樣品混懸液，同時按照1.3.1的劑量設定曲酸溶液陽性對照組和除樣品外的空白對照組，每樣設置3個平行。振蕩混勻后，于37 ℃恒溫箱中孵育10 min，每孔加入49 μL酪氨酸酶溶液，混勻，于37 ℃恒溫箱中孵育5 min，在-4 ℃冷凍離心機中以20 000 r/min離心5 min，每樣取10 μL添加于96孔酶標板中，酶標儀檢測每孔吸光度（A），檢測波長設定為475 nm。

表1 酪氨酸酶活性抑制試驗加樣表

1.3.5 結果計算

酪氨酸酶活性抑制率按式（1）計算。

式中：Y為酪氨酸酶活性抑制率；Ad為樣品反應孔吸光度；Ac為樣品本底孔吸光度；Ab為溶劑反應孔吸光度平均值；Aa為溶劑本底孔吸光度平均值。

1.3.6 曲酸標準曲線

以曲酸的濃度為橫坐標，其對應的酪氨酸酶抑制率為縱坐標，繪制曲線，擬合得到回歸方程（R2≥0.9）。根據回歸方程，計算酪氨酸酶抑制率為50%時對應的曲酸濃度，即為曲酸的IC50值。

1.4 統計學方法

試驗每樣設置3個平行，數據采用Excel（2016 MSO）表格進行整理，并采用SPSS（version 18.0，IBM）軟件分析處理，采用ANOVA檢驗5種檢測樣品酪氨酸抑制率的差別，雙側P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 曲酸標準曲線繪制結果

結果（表2和圖1）顯示，酪氨酸酶抑制率與曲酸濃度呈正相關關系，在濃度0.002～0.010 g/L之間酪氨酸酶抑制率增加幅度較高，而隨著濃度逐漸增加，曲酸對酪氨酸酶的抑制效果趨于平緩，最終在濃度0.04 g/L時達到87.255%。計算酪氨酸酶抑制率50%時，曲酸的對應濃度（IC50）為0.014 6 g/L，處于0.005～0.030 g/L范圍內，證明試驗檢測系統有效。

圖1 曲酸酪氨酸酶抑制率標準曲線

表2 曲酸標準濃度及對應的抑制率

2.2 樣品酪氨酸酶抑制率檢測結果

酪氨酸酶抑制率檢測結果顯示（圖2），燕麥、椰粉及煙酰胺單獨使用酪氨酸酶抑制率分別為11.62%，8.44%和1.54%。燕麥椰粉組合使用酪氨酸酶抑制率為23.93%，顯著高于燕麥和椰粉單獨使用抑制率（P＜0.05），且呈現一定協同作用；品牌A即食麥片酪氨酸酶抑制率為23.79%，與燕麥椰粉組合使用抑制效果一致，說明在品牌A即食麥片發揮主要作用的為燕麥和椰粉2種成分，這可能與復配產品中燕麥和椰粉成分總體占比較高有關。

圖2 5種樣品酪氨酸酶抑制率檢測結果

3 討論

曲酸是從曲霉真菌中分離出來的次生代謝產物，臨床上主要用于減輕色素和皮膚脫色[14]，對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性均具有較強的抑制作用，且呈現較好的量效反應關系，被證實最適合作為陽性對照的化合物[15]，在國內外體美白成分試驗研究[16-17]中均被廣泛應用。試驗中，曲酸的IC50為0.014 6 g/L，與其他相關研究結果一致[18]，表明試驗采用曲酸作為陽性對照結果可靠。

L-酪氨酸氧化是黑色素合成的起始步驟，酪氨酸酶是定位在黑色素小體膜上的糖蛋白，是研究黑色素異常沉積的分子靶標[19]。黑色素在細胞黑素小體的合成過程受酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYRP1）和l酪氨酸酶相關蛋白2（TYRP2）的調控，其中酪氨酸酶TYR和TYRP2是影響黑色素數量和質量的關鍵限速酶[20]，能夠催化L-酪氨酸羥基化為L-多巴醌（DQ），是黑色素合成的限速步驟[21]。酪氨酸酶的過量表達與黑色素的沉積等的發生有密不可分的關系[22-23]。當酪氨酸酶過量表達時，黑色素過度沉積而形成皮膚色斑，而酪氨酸酶表達不足則會引起白化病、白癜風等疾病[24]。而細胞氧化應激狀態下，皮膚表皮細胞內巰基氧化失去抑制TYR能力，也會導致黑色素的合成量增加[25]。一般來說不同膚色黑色素細胞中的酪氨酸酶表達量無明顯差異[26]，對酪氨酸酶進行活性調節成為影響黑色素合成的關鍵所在。在既往研究中，對氨酸酶的活性研究大多局限于中藥或提取物，但普通食物對酪氨酸酶的活性研究較少。

燕麥中多酚可抑制角質形成細胞中核因子Kappa B的活性和組胺釋放，減少皮膚皺紋，保護表皮細胞DNA免受包括紫外線照射在內的環境損害[27]。與此同時，燕麥中的β-葡聚糖上調鈣敏感受體（CaSR）的表達，增加細胞外鈣離子的敏感性，共同誘導角質形成細胞分化和神經酰胺合成[28]。椰肉中L-精氨酸及多酚化合物對超氧陰離子自由基、DPPH·自由基和羥基自由基均有較強的清除能力[29]。椰油通過降低細胞內ROS水平及提高細胞內超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT和谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px活性，起到保護細胞氧化應激損傷的作用[30-31]。盡管試驗原料，如燕麥和椰子粉中含有這些活性物質，但鮮有針對燕麥、椰子粉與酪氨酸酶直接作用的研究。

與此同時，依據該產品的配料信息，除燕麥椰子粉等，也含有一些藥食同源的傳統食材，如薏苡仁、山藥、茯苓等。藥食同源植物兼具營養價值及藥用價值，在普通食品、藥品及功能食品領域中被廣泛研究應用，其中薏苡仁、山藥、茯苓及白蕓豆作為傳統美白方劑如七白散、三白湯等的要藥，在增白祛斑等皮膚改善過程中發揮重要作用?，F代研究發現：薏苡仁可有效降低中波紫外線照射后人體HSF細胞中基質金屬蛋白酶1,3 mRNA表達，抵抗皮膚光老化[32]；山藥中山藥多糖和山藥皂苷促進人體成纖維細胞WS1分泌膠原，對移植性黑色素B16細胞增殖及黑色素形成具有很強的抑制作用[33]；茯苓抑制皮膚酪氨酸酶mRNA并提高皮膚轉化生長因子β-1和抗氧化蛋白的表達[34]。

隨著人們健康要求的提高，通過攝取的食品來調整機體的生理機能達到健康狀態替代對食品的感官單一要求。抑制黑色素形成和美白產品的研發思路主要以酪氨酸酶抑制劑為主，通過抑制酪氨酸酶活性和調節酪氨酸酶的轉錄作為美白添加劑的作用靶點，且研發多局限于護膚品范圍內，因此對具有抑制黑色素形成和美白功效的食品提出新的研發需求。配方在燕麥、椰子粉等可直接入食產品基礎上，添加煙酰胺鋅，并合理搭配藥食同源目錄中具有美白功效的原料，擬通過食用方式達到改善皮膚狀態的目的。經檢測，配方產品對酪氨酸酶活性具有一定抑制作用。

4 結論

綜上研究，燕麥、椰粉及傳統藥食同源原料在抑制酪氨酸酶活性及抑制黑色素形成上均發揮重要作用。在體外酪氨酸酶抑制率檢測中，燕麥、椰粉、煙酰胺鋅單獨使用或組合使用均具有酪氨酸酶活性抑制的功能，燕麥和椰粉組合表現出一定協同作用。該燕麥配方是否可通過食用方式直接作用于改善皮膚需進一步的臨床驗證和深入研究。然而，經體外試驗證實，品牌A即食麥片能夠抑制黑色素形成的關鍵酶——酪氨酸酶的活性，其中發揮主要作用的為燕麥和椰粉。