復方藍莓越橘顆粒制備及安全性評價

劉磊

1.神威藥業集團有限公司（石家莊 051430）；2.京津冀聯創藥物研究（北京）有限公司（北京 100025）

視疲勞的產生是眼或全身器質性因素與精神心理因素相互交織形成的結果[1-2]，通常以患者自覺眼部癥狀為突出表現，因此，在臨床上又常稱為眼疲勞綜合癥。近年來，隨著視屏終端設備和3D立體影像的普及和現代社會工作生活節奏的加快，視疲勞人群的范圍也在不斷擴大[3-4]。視疲勞成為影響人們生活、工作及身體健康的一大因素。具有緩解視疲勞功能的保健食品正逐漸成為市場焦點[5]，因此具有緩解視疲勞功能的保健食品投放市場，將為眾多視疲勞者帶來改善身體狀況的健康食品。

研究表明，藍莓提取物花青素對視物模糊、眼干澀、明視持久度及總有效率有明顯改善，可以起到緩解視疲勞的作用[6-7]。葉黃素存在于人體眼部所有組織中，但人體不能合成，只能通過攝入補充。研究表明葉黃素有助于視覺系統的發育，可提高視覺表現和低照明條件下的空間辨別度，對非增殖性糖尿病視網膜病變患者的視力有改善作用[8-11]。葉黃素和越橘提取物均具有緩解視疲勞的保健功效，二者復合使用具有協同增效的作用[12-13]。張莉華等[14]研究發現葉黃素、歐洲越橘提取物、藍莓粉等制成的咀嚼片，可明顯減輕視疲勞癥狀。葡萄籽提取物富含原花青素，有研究指出葡萄籽提取物中原花青素可能因其抗氧化性有助于預防與氧化應激相關的白內障[15]。木糖醇是食品中常用的甜味劑，其甜度與蔗糖相當，具有清涼感。因其具有防齲齒、不升糖等功效而被廣泛應用于飲料、糖果、無糖食品等各領域[16]。因此試驗選用木糖醇作為甜味劑。

藍莓粉、越橘濃縮粉、葉黃素、維生素A醋酸酯、維生素B6、葡萄糖酸鋅、亞硒酸鈉、木糖醇、葡萄籽提取物均具有緩解疲勞的功效，因此通過這幾種原料的復配，旨在開發一款具有緩解視疲勞功效的保健食品。通過查閱中醫藥理論及科學文獻，試驗原料無配伍禁忌，單個原料及用量具有安全性，但配伍后安全性尚沒有理論依據，因此進一步對復方藍莓越橘顆粒進行毒理安全性評價試驗，為其食用提供安全性依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓粉、越橘濃縮粉、葉黃素、葡萄籽提取物、維礦預混料（維生素A醋酸酯5 000 μg/g、維生素B675 mg/g、葡萄糖酸鋅100 mg/g、亞硒酸鈉500 μg/g、麥芽糊精）、麥芽糊精、木糖醇（均為SW公司）。

由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供的SD大鼠（質量合格證號：61001700001708，61001700001904）、昆明種小鼠（質量合格證號：61001700001747，61001700001743），均為SPF級。動物飼料、墊料（西安交通大學醫學院實驗動物中心）。試驗動物房為屏障系統，使用許可證號SYXK（陜）2012-006，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65%。

生化試劑盒（深圳邁瑞生物有限公司）；血細胞測定試劑；疊氮化鈉；1,8-二羥基蒽醌；2-氨基芴（Sigma Aldrich公司）；環磷酰胺、敵克松（江蘇盛迪醫藥有限公司）；大鼠肝微粒體酶（S9）；小牛血清；甲醇；磷酸鹽緩沖液（賽普銳思科技有限公司）；蒸餾水自制，合格備用。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101型，北京市永光明醫療儀器有限公司）；全自動生化分析儀（BS42型，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；血細胞分析儀（BC-2800vet型，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；電子天平（AP135W型，島津中國有限公司）；生物顯微鏡（RH3201型，南派大工科技有限公司）；離心機（TGL-16型，常州億通分析儀器制造有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-8型，常州億通分析儀器制造有限公司）；恒溫培養箱（SHPY-70F型，深圳市澳德瑪電子科技有限公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設備有限公司）；計時器；載玻片；試管；培養皿；解剖器械。

1.3 試驗方法

1.3.1 復方顆粒制備

1.3.1.1 工藝流程

原料過篩→稱量、混合→制軟材→制粒→干燥→整粒→包裝

1.3.1.2 配方優化

試驗在前期大量試驗研究工作基礎上，確定葉黃素和維礦預混料添加量分別為2%和1%。藍莓粉、越橘濃縮粉、葡萄籽提取物均含有原花青素等功效性成分，木糖醇有明顯清涼感，4種原料對終產品的口感風味影響較大，因此將原料按不同比例混合拼配，采用L9(34)進行正交試驗設計，以感官評分為評價指標，通過正交優化試驗對其用量進行篩選，確定終產品配方。因素水平設定如表1所示。

表1 正交因素水平表 單位：%

1.3.1.3 感官評價

取5 g成品，用100 mL溫水溶解，組織30名專業人員對產品進行感官評價，以溶液狀態、香味、風味口感作為考察指標進行打分，取平均值。評分標準如表2所示。

表2 產品感官評定標準

1.3.2 急性毒理試驗

選用SD大鼠20只，體重180～220 g，雌、雄各半。按最大耐受劑量法，設18.0 g/（kg·bw）為灌胃劑量（相當于人體推薦量的216倍）。將適量樣品粉碎，稱取180.0 g加蒸餾水至200 mL混懸，動物禁食16 h，不禁水，按20 mL/（kg·bw）經口灌胃1次，灌胃后連續觀察14 d內動物的一般健康狀況及死亡情況，試驗開始、第7和第14天稱量大鼠體重，試驗結束后處死動物大體解剖，根據最大耐受量判斷受試物的急性毒性。

1.3.3 Ames試驗

以多氯聯苯誘導的大鼠肝微粒體酶（S9）作為體外代謝活化系統，用間接致突變物（10 μg/皿的2-氨基芴用于TA97、TA98、TA100，50 μg/皿1,8-二羥基蒽醌用于TA102菌）測定S9活性。試驗采用TA97、TA98、TA100、TA102這4種菌株，樣品設5 000，1 000，200，40和8 μg/皿5個劑量組及溶劑對照組（蒸餾水）、自發回變組和陽性對照組。取適量樣品粉碎，準確稱取1.00 g，加蒸餾水至20 mL，混合均勻即為最高工作濃度5%的混懸液，試驗時取100 μL該工作液加入平皿即為樣品最高濃度（5 000 μg/皿），以最高濃度為基礎用蒸餾水逐步5倍稀釋即得其余所需濃度混懸液，高壓蒸汽滅菌（0.103 MPa，20 min）。在加和不加S9的試驗條件下進行平板滲入法試驗。每組作3個平行皿，重復試驗1次。-S9陽性對照物TA100用1.5 μg/皿的疊氮化鈉，其余3個菌株均采用50.0 μg/皿的敵克松；+S9陽性對照物TA102用50.0 μg/皿的1,8-二羥基蒽醌，其余3個菌株均采用10.0 μg/皿的2-氨基芴。每組加入陽性對照的體積為0.1 mL。

1.3.4 小鼠骨髓細胞微核試驗

采用昆明種小鼠50只，體重25～30 g，雌雄各半。將小鼠隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。試驗設計：設10.0，5.0和2.5 g/（kg·bw）為3個劑量組，另設溶劑對照組（蒸餾水）及環磷酰胺陽性對照組[CP，40 mg/（kg·bw）]。樣品配制：稱取20.0 g樣品加蒸餾水至40 mL，混合均勻作為高劑量，取20 mL高劑量混懸液，用蒸餾水依次倍比稀釋作為中、低劑量，用蒸餾水作為溶劑對照。另外取0.04 g CP加蒸餾水至20 mL，溶解，備用。灌胃體積按2 mL/（100 g·bw），試驗采用30 h灌胃法，2次間隔24 h，于第2次給樣品后6 h取股骨骨髓涂片，固定，Giemsa染色后，在油鏡下每只小鼠計數1 000個嗜多染紅細胞（PCE）中的微核細胞數，計算微核的千分率。觀察200個嗜多染紅細胞中成熟紅細胞數，并計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值（PCE/NCE）。

1.3.5 小鼠精子畸形試驗

采用雄性昆明種小鼠50只，體重25～35 g，將小鼠隨機分為5組，每組10只。設有10.0，5.0和2.5 g/（kg·bw）3個劑量組，另設溶劑對照組（蒸餾水）及陽性對照組[CP，40 mg/（kg·bw）]。樣品配制：稱取20.0 g樣品加蒸餾水至40 mL，混合均勻作為高劑量，取20 mL高劑量混懸液，用蒸餾水依次倍比稀釋作為中、低劑量，用蒸餾水作為溶劑對照。另外取0.04 g CP加蒸餾水至20 mL，溶解，備用。灌胃體積按2 mL/（100 g·bw），每日經口灌胃1次，連續灌胃5 d，于首次給樣品后第35天，脫頸椎處死動物，取雙側附睪進行制片，經甲醇固定、1%伊紅染液染色后，在高倍鏡下每只動物計數1 000條完整精子，記錄精子畸形數、畸形類型，并計算精子畸形率。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0 for Windows軟件對數據進行統計分析，所有數據均以平均數±標準差（D）表示。小鼠骨髓細胞微核試驗采用卡方檢驗，小鼠精子畸形試驗采用秩和檢驗，30 d喂養試驗數據經方差齊性檢驗。

2 結果與分析

2.1 復方顆粒制備

通過L9(34)進行正交優化試驗，以感官評分為評價指標。結果如表3所示。

由表3可知，各因素影響感官評分的主次順序為：葡萄籽提取物添加量＞木糖醇添加量＞越橘濃縮粉添加量＞藍莓粉添加量。依據正交試驗結果可知，最優配方為A2B1C1D3。

表3 正交試驗結果

該優選配方組合未出現在正交試驗組合中，因此對該配方進行工藝驗證，并對制備成品進行感官品評。該優化配方的評分結果為43分，優于正交試驗中任一組合。因此該優選配方A2B1C1D3結果可靠，即藍莓粉30%、越橘濃縮粉1.5%、葡萄籽提取物1%、木糖醇32%。

2.2 急性毒性試驗

18.0g/（kg·bw）的劑量給予大鼠灌胃后，大鼠生長良好、行為正常、反應敏捷、體重增加、無明顯中毒癥狀，觀察14 d動物無死亡。試驗結束后解剖動物，大體觀察肝、腎、脾、心、肺、胃、腸等主要臟器，均未見明顯異常。結果表明，復方藍莓越橘顆粒對大鼠急性毒性MTD大于18.0 g/（kg·bw），依據急性毒性分級標準，大鼠急性毒性為無毒級。試驗結果如表4所示。

表4 復方藍莓越橘顆粒對大鼠急性毒性試驗結果（D）

表4 復方藍莓越橘顆粒對大鼠急性毒性試驗結果（D）

2.3 Ames試驗

無論在加和不加S9的條件下，各劑量組的回變菌落數均未超過自發回變菌落數的2倍，無劑量關系。試驗結果表明復方藍莓越橘顆粒試驗結果為陰性，無致突變遺傳毒性。試驗結果如表5和表6所示。

表5 復方藍莓越橘顆粒Ames試驗結果（第1次）（D）

表5 復方藍莓越橘顆粒Ames試驗結果（第1次）（D）

表6 復方藍莓越橘顆粒Ames試驗結果（第2次）（D）

表6 復方藍莓越橘顆粒Ames試驗結果（第2次）（D）

2.4 小鼠骨髓細胞微核試驗

復方藍莓越橘顆粒各劑量組小鼠骨髓細胞微核率與溶劑對照組比較，差異均無顯著性（P＞0.05），陽性對照組的微核率均顯著高于溶劑對照組（P＜0.01），各劑量的PCE/NCE值均在正常范圍內，且各劑量組PCE/NCE值均不少于溶劑對照組的20%，提示復方藍莓越橘顆粒對小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性，復方藍莓越橘顆粒無染色體改變遺傳毒性。試驗結果如表7所示。

表7 復方藍莓越橘顆粒對小鼠骨髓細胞微核試驗結果

2.5 小鼠精子畸形試驗

各劑量組精子畸形率與溶劑對照組比較，秩和檢驗差異均無顯著性（P＞0.05），陽性對照組顯著高于溶劑對照組，差異有顯著性（P＜0.01）。試驗結果表明復方藍莓越橘顆粒對小鼠精子畸形試驗結果為陰性，復方藍莓越橘顆粒對小鼠精子無致畸作用。試驗結果如表8所示。

表8 復方藍莓越橘顆粒對小鼠精子畸形試驗結果

3 結論

通過正交試驗研究，確定復方藍莓越橘顆粒最終產品配方：藍莓粉30%、葉黃素2%、越橘濃縮粉1.5%、葡萄籽提取物1%、維礦預混料1%、木糖醇32%、麥芽糊精32.5%。經制備，成品外觀均勻、風味口感良好。食用安全性試驗表明，復方藍莓越橘顆粒對大鼠急性毒性MTD大于18.0 g/（kg·bw），依據急性毒性分級標準，大鼠急性毒性為無毒級。Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗結果均為陰性。綜上所述，復方藍莓越橘顆粒配方工藝較為合理，且成品具有較高的食用安全性。