艾沙康唑、伏立康唑、兩性霉素B對我國多中心臨床分離絲狀真菌的體外藥物敏感性評估

井然，郭大文，王俊瑞，賀靖冬，王瑤，徐英春*

1中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京協和醫院，北京 100730；2中國醫學科學院北京協和醫學院，北京 100730；3侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730；4哈爾濱醫科大學附屬第一醫院檢驗科，哈爾濱 150007；5內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古 750306；6天津市胸科醫院檢驗科，天津 300051

近年來，隨著抗真菌藥、激素、免疫抑制劑的廣泛使用和侵入性治療的增加，我國和其他國家一樣，侵襲性肺曲霉病和毛霉病發病率逐漸增高[1-2]。

目前，伏立康唑（voriconazole，VOR）是被推薦用于治療侵襲性肺曲霉病的主要抗真菌藥物[3]，然而對VOR耐藥的煙曲霉感染患者的報道越來越多[4]。兩性霉素B（amphotericin B，AMB）被推薦用于治療毛霉病[5]，但存在藥物不良反應，如腎毒性等[6]。因此，目前用于治療侵襲性真菌病的藥物十分有限。國外已有研究報道艾沙康唑（isavuconazole，ISA）對大范圍的酵母菌和絲狀真菌有較強的體外活性[7-8]。本研究旨在評估ISA對我國多中心臨床分離的曲霉屬和毛霉目菌株的體外活性，為指導臨床治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集來自2017～2020年中國醫院侵襲性真菌病監測網（CHIF-NET）中國北方，包括北京、天津、內蒙古、河北、黑龍江、吉林、遼寧和山西8個地區合作醫院的臨床分離絲狀真菌，共計131株。所有菌株統一傳種在沙氏葡萄糖瓊脂培養基[Sabouraud Dextrose Agar，SDA （Thermo Fisher Scientific）]，于28℃孵育3～7天。

1.2 研究方法

1.2.1 菌種鑒定

所有菌種采用傳統形態學結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）進行鑒定，同時對未鑒定出結果的菌株進行rDNA的ITS區域或28S rRNA的D1/D2區測序。

1.2.2 藥物敏感性檢測

依據CLSI M38-A3的微量肉湯稀釋法進行體外藥物敏感性檢測[9]，藥敏板由IHMA（Europe Sarl）提供，包含3種抗真菌藥物，即ISA（MICs：0.008～8μg/ml）、VOR（MICs：0.008～8μg/ml）和 AMB（MICs：0.06～8μg/ml），其中VOR和AMB作為研究ISA敏感性的參考類抗真菌藥。近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作為藥敏試驗的質控菌株，煙曲霉ATCC MYA-3627TM和黃曲霉ATCC 204304TM作為參考菌株[10]。

1.2.3 數據分析

依據CLSI M59和CLSI M57S[11-12]，目前只建立了 VOR、ISA和AMB對常見的曲霉屬，包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉的流行病學界值（epidemiological cutoffvalues， ECVs）。尚未建立毛霉目的ECV，因此通過計算50%最低抑菌濃度（50% minimun inhibitory concentration，MIC50）和90%最低抑菌濃度（90% minimun inhibitory concentration，MIC90）來評估抗真菌藥對毛霉目的體外活性[11-12]。

2 結果

2.1 菌種鑒定

臨床共分離絲狀真菌131株，最終鑒定出曲霉屬105株和毛霉目26株。105株曲霉屬中，煙曲霉復合群（A.fumigatuscomplex）占所有曲霉屬的71.4%（75/105），其次是黑曲霉復合群（A.nigercomplex）占10.5%（11/105），黃曲霉復合群（A.flavuscomplex）占9.5%（10/105）和土曲霉復合群（A.terreuscomplex） 占 8.6%（9/105）。 在 26株 毛 霉 目中，以根霉屬為主，占50%（13/26）[其中，米根霉/少根根霉（R.oryzae/R.arrhizus）占84.6%（11/13），小孢根霉（R.microspores）和匍枝根霉（R.stolonifera）各有1株]。其次為根毛霉屬[占15.4%（4/26），包含3株微小根毛霉（R.pusillus）和1株米黑根毛霉（R.miehei）]和橫梗霉屬[占15.4%（4/26），均為分枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）]。最后為共頭霉屬[占 11.5%（3/26），均為總狀共頭霉（S.racemosum）]和毛霉屬[僅有2株，均為卷枝毛霉（M.circinelloides）]。

2.2 ISA、VOR和AMB對不同曲霉屬體外藥物敏感性比較

研究總結了ISA、VOR和AMB對不同曲霉屬的作用效果（見圖1）。根據CLSI-M59對部分曲霉ECVs的判斷標準[11]，當測定某一抗真菌藥對某菌株的MIC值≥ECV值時，該菌株被定義為對這種抗真菌藥的非野生型菌株，在本研究中我們可以解釋為 “耐藥”；相反，當MIC值

圖1 ISA、VOR和AMB對不同曲霉屬的體外藥物敏感性交叉比較

如圖1A所示，在75株煙曲霉復合群中，有67株（67/75，89.3%）對AMB耐藥。在對AMB耐藥的煙曲霉復合群的菌株中，有4株對ISA和VOR耐藥（6.0%，4/67），剩余63株對ISA和VOR均敏感。對比AMB，煙曲霉復合群對ISA和VOR 2種唑類藥物同時敏感的菌株占比為92.0%（69/75）。此外，對ISA耐藥的6株煙曲霉復合群菌株中，有5株VOR耐藥株和1株VOR敏感株。

如圖1B所示，在10株黃曲霉復合群菌株中，10株均對VOR敏感，有2株對ISA耐藥。在對AMB耐藥的4株菌株中，有1株對ISA耐藥。對比AMB，黃曲霉復合群對ISA和VOR 2種唑類藥物同時敏感的菌株占比為80.0%（8/10）。

如圖1C所示，在11株黑曲霉復合群中，有4株對AMB耐藥的同時，對ISA和VOR敏感。對比AMB、ISA和VOR對黑曲霉復合群均有較好的活性，均敏感（100%）。

如圖1D所示，在9株土曲霉復合群中，僅1株菌（11.1%，1/9）對AMB耐藥，9株（100%）均對ISA和VOR敏感。

2.3 ISA、VOR和AMB對毛霉目體外藥物敏感性分析

體外藥敏結果顯示（見表1），VOR對所有毛霉目均無活性，MIC值范圍為4～>8 μ g/ml，中位數 MIC 值（mMIC）、MIC50和 MIC90均>8 μ g/ml。ISA對毛霉目的藥敏結果顯示，毛霉屬和共頭霉屬對ISA的MIC值范圍分別為0.5～8μg/ml和0.5～>8μg/ml，各有1株卷枝毛霉和總狀共頭霉對ISA耐藥（MIC>8μg/ml）。ISA對根霉屬、根毛霉屬和橫梗霉屬有較強的體外活性，MIC值范圍分別 為 0.06～2、0.25～1μg/ml和 0.06～2μg/ml。 對比VOR和ISA，AMB對毛霉目不同種均有較好的活性，MIC值范圍為0.12～2μg/ml。

表1 ISA、VOR和AMB對毛霉目的體外藥物敏感性μg/ml

3 討論

近些年，侵襲性霉菌感染的發病率逐年升高[13]，除曲霉屬為主要病原體外，毛霉目是另一類常見的病原體。由于近年來新冠肺炎疫情，許多國家報道了新冠肺炎（COVID-19）合并肺曲霉病和毛霉菌肺炎的病例[14-18]。毛霉病與血管侵犯有關，死亡率高于侵襲性肺曲霉病，可達50%～70%[19]，且在糖尿病患者中的發病率逐漸增高[20-23]。

ISA已于2015年被美國食品藥品監督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）獲批用于治療侵襲性肺曲霉病和毛霉病，同時ISA也被推薦作為治療侵襲性霉菌感染的一線藥物[24]。

但隨著煙曲霉對唑類藥物耐藥不斷被報道[4]，當遇到唑類藥物耐藥的煙曲霉感染時，AMB可作為治療方案[24]。然而，大規模和長期使用AMB可能會降低其對煙曲霉復合群的敏感性，逐漸出現對AMB耐藥的煙曲霉復合群菌株。如加拿大報道了AMB對一批煙曲霉菌株有更低的敏感性，耐藥率達96.4%（188/195），高于本研究中煙曲霉復合群菌株對AMB的耐藥率（89.3%）[25]。本研究為我國首次開展的多中心ISA對臨床分離的絲狀真菌的體外藥物敏感性評估，結果顯示對煙曲霉復合群、黃曲霉復合群、黑曲霉復合群和土曲霉復合群，VOR和ISA的作用效果相似。此外，有研究指出與VOR相比，ISA有更廣泛的活性譜（包括對大多數毛霉目真菌）及良好的耐受性，可加載劑量后每日1次給藥，且其為線性藥動學，具有水溶性和更少的細胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）介導的藥物與藥物間的相互作用[26-27]。基于此，提示ISA同樣可以作為治療侵襲性曲霉感染的治療藥物[27]。

根據相關指南推薦[28]，治療毛霉病的一線抗真菌藥是AMB。本研究結果與指南推薦一致，即AMB對毛霉目菌株均有較好的活性（MICs為0.12～2μg/ml）。雖然AMB是有效的，但會產生腎毒性等不良反應，在治療毛霉病時需要控制好使用劑量和治療時間[29-30]。本研究結果顯示，VOR對所有毛霉目均無活性（MICs為4～>8 μ g/ml），與國外相關報道的結果一致[31-33]。

本研究尚存在一些局限型。首先，收集的菌株來自中國北方地區的合作醫院，所以目前的藥敏數據僅可代表中國北方地區的臨床菌株的藥敏表型，未來需擴大更多的合作醫院，收集來自全國各個區域的臨床菌株進行全國多中心的研究；其次，由于臨床毛霉目菌株十分有限，目前只收集到了26株，未來仍需繼續擴大范圍和累積收集年限，收集更多毛霉目菌株。

綜上所述，本研究多中心體外藥敏結果可為臨床治療侵襲性肺曲霉病和毛霉病的參考，即ISA對曲霉屬的體外活性不次于VOR，且對大部分毛霉目具有良好活性，可作為治療初級侵襲性霉菌感染的治療藥物；而VOR對所有毛霉目均無活性；AMB對毛霉目的活性較強，但需要注意在治療侵襲性霉菌感染中其帶來的不良反應。