膿毒癥動物模型的制備方法及影響因素

李 瀟, 顏海鵬, 肖政輝

(南華大學兒科學院,湖南省兒童醫院重癥醫學科,長沙 410007)

膿毒癥（sepsis）是宿主對感染的反應失調而引起的危及生命的器官功能障礙［1］。全球流行病學調查數據顯示，膿毒癥和嚴重膿毒癥住院病死率分別為17%和26%；國內多項流行病學調查結果也與之相似，該病是困擾重癥監護病房醫生的棘手問題之一［2-3］。膿毒癥病程受多種因素的影響。為了更好地研究膿毒癥的病理機制，尋找更加合理的臨床診療措施，學者們嘗試建立各種膿毒癥動物模型以模擬人類膿毒癥的病程。然而膿毒癥的臨床前動物模型很難完全復制臨床上人類膿毒癥的復雜性，并受到多種因素的影響和制約，現將這些因素綜述如下。

1 膿毒癥模型的建立方法

結合近些年研究可知，現有的膿毒癥動物模型制備方法大致分為四類：（1）注射外源性毒素模型；（2）注射外源性活菌模型；（3）腹腔感染模型；（4）腹腔外膿毒癥模型。其中前三種最為常用。

1.1 注射外源性毒素模型

向動物體內注射外源性毒素可建立膿毒癥動物模型。例如內毒素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導機體產生炎性因子，通過介導適應性免疫或產生放大的級聯反應，促使全身炎性反應發生?？赏ㄟ^靜脈、腹腔等不同途徑向動物體內輸注LPS，根據劑量和方法不同，分為小劑量一次性輸注、小劑量持續輸注和大劑量一次性輸注。小劑量單次輸注LPS，引起宿主的器官功能損傷較輕，自愈率較高。大劑量單次輸注LPS 通常會導致心輸出量降低，血管阻力正?；蛟黾?，與膿毒癥早期高排低阻改變（即全身血管阻力下降，并伴有高心排血量）不符，引起的宿主炎性反應過重，死亡率過高，且致死的原因非膿毒癥而是毒血癥，與研究目的不符［4］。持續小劑量輸注可較好地模擬人類早期高動力和晚期低動力的變化，同時伴有免疫系統的激活，能達到與臨床膿毒癥相似的死亡率，適于研究抗炎復合物如炎性小體的作用以及炎性級聯反應的激活機制。但注射LPS 導致細胞因子短期急速升高，與人類膿毒癥病程中產生低而持久可檢測的細胞因子水平不符，有一定局限性［5］。

1.2 注射外源性活菌模型

膿毒癥是細菌及其細胞壁成分LPS 釋放入血導致的全身炎性反應。通過腹腔或靜脈注射細菌如大腸埃希菌，能引起機體炎性介質如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細胞介素（interleukin，IL）-1β 快速升高，產生的宿主反應與毒素中毒模型相似，且腹腔內給藥產生的炎性反應較靜脈給藥途徑減弱。輸注外源細菌可導致彌散性血管內凝血，并參與微血管內皮細胞的活動，擾亂抗凝機制，同時可引起低血壓休克，適于研究宿主對病原體的反應機制，探討針對組織因子及其受體途徑的干預方法［5-6］。但該模型缺少類似于臨床膿毒癥的感染源，且膿毒癥通常是多菌性的，單一菌株的使用不能很好地反映膿毒癥的臨床表現。

1.3 腹腔感染模型

腹腔感染是膿毒癥患者最常見的感染源，且腹腔感染模型操作簡便，可重復性高，得到了廣泛應用。有研究發現，64%的高被引膿毒癥動物相關研究使用了盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and puncture，CLP）［7］。CLP 模型通過將盲腸結扎穿孔，使腹腔內少量持續溢入混有多種細菌的腸內容物，重現了多菌性腹膜炎的臨床特點，同時可呈現出促炎和抗炎免疫反應的激活、持續的炎性反應、早期高動力和晚期低動力循環狀態、多器官功能障礙及細胞因子反應的類似動力學變化。且通過控制結扎盲腸的長度及穿孔所用針頭大小、穿孔數目等因素可調控膿毒癥模型動物的死亡率，適于評估腹腔內感染［5，8-9］。但CLP模型可形成腹腔內膿腫和腹膜炎兩種情況，模型的壞死組織也缺少像臨床上手術切除的干預方式，所以有研究者提出可通過建立升結腸支架植入腹膜炎（colon ascendens stent petitonitis，CASP）模型解決這個問題。

CASP 模型是將一個固定管徑的支架植入升結腸，使腸內容物持續滲漏到腹腔中，造成急性多菌性膿毒癥性腹膜炎。膿毒癥的嚴重程度可通過改變支架直徑或在二次手術中移除支架并縫合腸穿孔來調節［10-11］。研究發現，當支架在3 h 內被移除時，小鼠預后較佳，而當支架植入超過9 h后被移除，小鼠死亡率增加。該模型血流動力學較穩定，炎性因子水平穩步、持續增長，常引起多器官功能障礙，適用于彌漫性腹膜炎新治療方法的評價。但也有研究發現，隨著細胞因子的快速升高，大鼠模型肝臟中促炎因子表達較多，抗炎因子表達較少，與肺中促炎因子表達較少而抗炎因子表達較多的情況相反，可能出現全身炎性反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和代償性抗炎反應綜合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS）在不同部位同時發生［12］。有學者提出盲腸結扎和切口（cecal ligation and incision，CLI）模型能更好地模擬膿毒癥的急性發作，適用于膿毒癥血流動力學改變和血氣分析的短期研究［5］。但CLI 模型的應用還不廣泛，其代謝、血流動力學和免疫反應的特征尚未充分闡明。

將實驗動物盲腸內容物腹腔注射到其他動物體內的盲腸漿液注射模型（cecal slurry injection，CS）是誘導多微生物膿毒癥的另一種方法。新生小鼠器官體積小，腸道發育不完全，盲腸結扎和穿刺難度高，故CS模型適用于研究新生兒膿毒癥，且避免了手術模型造成組織損傷和缺血的影響［13］。

1.4 腹腔外膿毒癥模型

有60%的臨床前膿毒癥模型采用的是腹腔感染模型，但在測試新的治療方法時，腹腔外膿毒癥模型也很重要。通過向氣管或鼻腔內注入細菌，進而誘發肺部感染的動物模型，可用于研究膿毒癥的局部病理情況。該模型的實驗操作簡單且可重復性高，能引起多器官損傷；但其細胞因子水平具有菌株特異性，病程受所選菌株和接種劑量、抗生素的影響，存在一定局限性［5，14］。

2 建立膿毒癥模型的考慮因素

2.1 實驗動物種類和品種品系

膿毒癥動物模型在進一步了解膿毒癥復雜病理生理機制方面具有重要作用，其中動物的選擇是動物模型建立的首要問題，關系到模型能否成功復刻臨床。雖然許多物種與人類有共同的發病途徑，但在膿毒癥方面，物種間的差異是顯著的。

目前可用于建立模型的動物種類較多，學者們根據不同動物種類各自的特點，將其用于不同目的的研究。大型哺乳動物如豬、犬和靈長類，其遺傳背景、生理特點與人類相似，可對血液和組織進行連續取樣、連續監測器官功能狀態，適于觀察疾病發生發展過程，研究膿毒癥的基本機制，但成本昂貴，常用于新治療藥物和治療模式的最終試驗。如靈長類動物黑猩猩，對于評價膿毒癥免疫炎性反應具有重要價值。豬、犬多用于研究多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），也可進行離體細胞培養。小型哺乳動物如大鼠、小鼠、豚鼠等嚙齒類動物，價格低廉，操作方便，易于進行轉基因或基因敲除，用于觀察膿毒癥的病理生理變化，進行生存率及基因相關疾病機制研究［15-16］。

目前94%的膿毒癥模型相關研究使用了嚙齒類動物，其中小鼠模型占79%［17］。關于膿毒癥建模的現有文獻中，大多數實驗選擇了C57BL/6 小鼠。但小鼠總血容量過少，難以連續采集血液或組織樣本以評估病理過程的時間依賴性，且有創性監測如血流動力學技術的使用受限，難以評估膿毒癥的嚴重程度及所處階段。

2.2 動物年齡

流行病學調查表明，年齡是膿毒癥患者死亡率的獨立預測因素，是決定膿毒癥風險和預后的關鍵因素，而且在成年人群中膿毒癥病死率隨著年齡的增長呈線性增加。有研究者通過回顧性分析發現，年齡是小兒膿毒癥嚴重程度的決定因素，年齡越小，病死率越高，3歲前嬰幼兒死亡率高于3歲后的兒童和青少年［18-19］。小鼠生長周期可分為新生期（1 周齡）、幼齡期（3～8周）、成熟期（2～4 月齡）和中老年期（＞4 月齡），可根據實驗目的與方法選擇合適發育周期的小鼠進行實驗。

目前新生小鼠膿毒癥造模推薦選用CS模型，通過腹腔注射盲腸漿液（1.1～1.3 mg/g）模擬新生兒腸穿孔引起的多微生物膿毒癥，其死亡率具有全身炎癥和劑量依賴性的特點。對于幼齡期、成熟期及中老年期小鼠，大多采用注射外源性毒素模型及腹腔感染膿毒癥模型，無論是CLP、CASP 還是CS、LPS，既依賴于劑量，也受多種因素如穿孔數目、植入支架直徑等影響。目前大多數實驗選用6～12周齡小鼠。在CLP及LPS模型中均發現老年小鼠死亡率更高（65%vs 20%），IL-6和TNF-α等炎性細胞因子水平更高，對抗炎性刺激的免疫反應能力更低，抗生素療效愈差的特點［5，13，20］。

2.3 動物性別

性別差異影響膿毒癥的發病率和預后。對2001—2012年包括6 134例成人膿毒癥患者數據的回顧性分析表明，男性膿毒癥患者90 d 和1 年死亡率及住院期間死亡率均較女性高，分別為45.1%比42.1%，55.6%比51.4%，33.8%比31.3%，女性臨床結局優于男性患者的原因可能與激素的分泌、調節相關［21］，也可能與X染色體上一些基因參與調節免疫相關蛋白質編碼、mRNA 轉錄有關，還可能是因為多態性X-連鎖基因與細胞嵌合能使女性更好地對抗感染。同時睪酮可通過激活非基因組途徑調節的絲裂原活化蛋白激酶信號等機制起到免疫抑制作用［22-24］。

研究發現，雌激素水平低下組小鼠巨噬細胞釋放IL-1β 和IL-6 的量與正常組小鼠相比明顯降低，提示雌激素有利于免疫功能的維持［25］。相對于雌激素變化明顯的雌鼠來說，雄鼠可能更適合大多數膿毒癥建模相關研究，而對于研究性激素作用及妊娠、卵巢切除術后對感染的易感性及其病理生理機制研究，則雌鼠更具價值。

2.4 輔助治療

臨床前膿毒癥模型為了更接近臨床，應盡量使用基本的輔助治療，也可根據實驗目的而定。膿毒癥常會導致血壓下降和組織灌注不足。2016 年的膿毒癥和膿毒性休克管理國際指南建議，在確診膿毒癥或膿毒性休克后1 h 內應開始經驗性靜脈注射抗生素，3 h 內靜脈注射至少30 mL/kg 的等滲晶體液。早期積極的液體復蘇可顯著增強膿毒癥小鼠模型的臨床相關性，并且將CLP小鼠術后4 d的存活率提高60%。而早期體液復蘇不足可能無法復制臨床膿毒癥中出現的血流動力學異常狀態。實驗動物可通過靜脈、皮下和腹腔內給藥，為了密切模擬臨床，液體復蘇應通過靜脈途徑進行，但在靜脈通路有限的小動物模型中，優先選擇腹腔內給藥，因此需結合模型的類型和研究目的選擇合適的給藥途徑［26-27］。

抗生素的使用是早期治療膿毒癥及膿毒性休克的關鍵步驟，能提高CLP 術后實驗動物存活率，但不是膿毒癥模型中炎性反應和預后的主要決定因素。而且抗生素劑量需根據具體實驗模型選擇，目前尚無統一的給藥方案。膿毒癥和膿毒性休克管理國際指南建議，經驗性使用廣譜抗生素或基于模型和可能或已知的病原體選用抗生素。如對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌可用β-內酰胺類治療，對大腸埃希菌用第二代或第三代頭孢菌素或氨基糖苷治療；對多種微生物感染，如腸穿孔（如CLP 和CASP 模型），可以使用廣譜抗生素如碳青霉烯，或覆蓋G+和G-需氧菌和厭氧菌的藥物組合治療。有學者曾對190 項小鼠膿毒癥研究進行回顧性分析，結果顯示β-內酰胺類使用最頻繁（90%）。另外，感染部位也影響抗生素的選擇，不能有效穿過血腦屏障的抗生素不適用于中樞神經系統感染。在大多數小型嚙齒類動物膿毒癥研究中，抗生素為皮下給藥，大型哺乳動物的研究中推薦靜脈注射給藥［26，28］。

2.5 并發癥

膿毒癥患者臨床上常伴有如肝腎疾病、糖尿病等慢性病。研究表明膿毒癥患者平均伴有1.07個并發癥。目前動物模型基本使用健康、年輕的動物，而理想的膿毒癥動物模型應能模擬臨床膿毒癥的特點。但合并腎損傷的CLP模型血管通透性增加，細菌清除率下降，膿毒癥程度比簡單CLP 模型更重，且膿毒癥存在凝血障礙會影響肝素治療的效果。因此，可能復雜的膿毒癥動物模型更適于評價藥物療效，研究有并發癥的膿毒癥動物模型更具臨床意義［29］。

3 建立CLP模型的影響因素

大多數研究采用CLP 建立膿毒癥模型，而在CLP手術操作過程中還有許多值得考慮的因素。

3.1 鎮痛、鎮靜方式選擇

在動物模型中，疼痛能影響動物行為和免疫系統功能。膿毒癥模型推薦使用鎮痛藥物，鎮痛藥成為影響膿毒癥模型存活率及炎性反應的重要因素。目前對于臨床膿毒癥患者使用鎮痛藥的類型及劑量尚無具體建議，且在臨床前膿毒癥研究中也較少提及。丁丙諾啡是嚙齒類動物模型中最常用的鎮痛藥，在小鼠CLP模型中，通常是腹腔內或皮下注射，且尚無推薦劑量，大部分研究所使用劑量為0.05～0.1 mg/kg。研究發現，在膿毒癥免疫相關機制的研究中應用丁丙諾啡對小鼠存活率、細胞因子水平的影響不大，相比于易導致細菌移位及促進細菌生長的嗎啡，免疫抑制作用較弱的阿片類藥物可能更適用于膿毒癥炎癥相關的研究［30］。

動物實驗常需對動物進行麻醉。有研究表明，揮發性麻醉劑可增強巨噬細胞的吞噬作用，并降低TNFα、IL-1β mRNA 的表達，在一定程度上保護了體內缺血再灌注損傷的組織器官，縮短術后恢復時間，延長膿毒癥小鼠的生存期［31-32］。而水合氯醛的麻醉效果僅為催眠鎮靜作用，依據動物倫理目前已不推薦腹腔注射水合氯醛用于動物麻醉［33］。Herrmann等［32］發現異氟烷麻醉在小鼠CLP 模型中對器官功能損傷、生存率的改變不明顯，未顯著影響預后。七氟醚、地氟醚麻醉可顯著提高7 d生存率，減輕器官損傷，降低組織損傷標志物的表達。

目前在膿毒癥模型中，鎮痛鎮靜方式的選擇、劑量選定、適用研究方面的文獻不多，還待進一步研究摸索。

3.2 盲腸結扎長度及穿刺針的大小、數量

在CLP 模型中，盲腸結扎長度、穿刺針型號、穿孔數量都被認為與膿毒癥模型損傷嚴重程度相關，且作為影響模型死亡率的重要因素。研究發現，在穿刺針大小和穿孔數量等影響因素一致的情況下，盲腸結扎穿孔長度是膿毒癥嚴重程度的獨立決定因素；結扎距離大于盲腸長度的5%時（約0.3 cm）才開始出現死亡，膿毒癥嚴重程度及死亡率隨結扎長度增加而提高［5，34］。但也有學者提出，盲腸結扎長度對膿毒癥小鼠72 h 生存率無明顯影響，生存率取決于盲腸體積而不是長度。因實驗動物的盲腸形狀不規則，盲腸長度在結扎穿刺過程中易發生變化，所以盲腸體積相對于長度來說能夠更精確地控制感染灶大?。?5］。

使用不同型號的針頭，小鼠7 d 死亡率也不同，18 G 為100%，21 G 為50%，25 G 為5%，膿毒癥的嚴重程度隨穿刺針頭直徑增加而加重。隨著穿刺針直徑增大和穿孔數增多，糞便流入腹腔的速度越快，感染越重。因此，實驗中通過把控盲腸結扎長度、穿刺針型號、穿孔數量等因素可能使CLP 模型的器官損傷、炎性反應、死亡率等得到控制［36］。

4 結語

綜上所述，腹腔感染模型（如CLP）及注射外源性毒素模型（如注射LPS）是目前較為常用的膿毒癥病理生理機制研究模型。建立穩定的動物模型的影響因素包括動物種類、品種品系、年齡、性別、輔助治療等。通過動物模型能夠系統研究膿毒癥期間許多炎性介質、通路的作用以及阻止其產生、傳遞后的影響，但其臨床前模型的預測價值有限，可能與動物和人類對感染反應程度不同、細胞的轉錄和表達相關性差、模型全身炎性反應不重及未出現MODS 等因素有關。膿毒癥在中后期可出現長期免疫抑制狀態，這時的死亡率較高，應為膿毒癥治療重點。目前，臨床前實驗研究尚缺乏針對膿毒癥致MODS 的病理生理過程及臨床特點的研究模型。有學者提出使用CLP 模型結合二次打擊模型，即最初的創傷或感染發作后誘導繼發感染，更接近臨床上膿毒癥晚期的實際免疫抑制狀態，有助于闡明CLP 改變免疫功能的機制。也可嘗試將嚴重疾病中出現的人類患者來源的病原體植入實驗小鼠，模擬關鍵宿主的病原體相互作用［37-38］。但這些研究成果尚未轉化為有效的新療法，期待在后續的模型研究中能實現評估膿毒癥治療新策略的突破。

[作者貢獻Author Contribution]

李瀟提出文章思路，撰寫、修訂文章；顏海鵬對文章思路有重要建議，對文章框架及內容作批評性審閱；肖政輝對文章的知識性內容作批評性審閱，指導性支持。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。