惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲抗原檢測(cè)試劑盒的臨床研究

柯天霖

（廈門國(guó)貿(mào)健康科技有限公司，福建廈門 361000）

瘧疾（Malaria），是一種由寄生蟲引起的威脅生命的疾病，通過(guò)受感染的雌蚊叮咬傳至人類，其病原體為瘧原蟲。臨床表現(xiàn)為間歇性、定時(shí)性、發(fā)作性的寒戰(zhàn)、高熱和大汗，以及貧血和脾腫大[1]。感染人類的瘧原蟲種類主要有五種，包括：惡性瘧原蟲（Plasmodium Falciparum，Pf）、間日瘧原 蟲（Plasmodium Vivax，Pv）、三日瘧原蟲（Plasmodium Malariae，Pm）、卵形瘧原 蟲（Plasmodium Ovale，Po）以及諾氏瘧原蟲（Plasmodium Knowlesi，Pk）。其中間日瘧分布最廣，遍及熱帶、亞熱帶、溫帶的國(guó)家和地區(qū)，以中美和東南亞地區(qū)為多見；惡性瘧最為嚴(yán)重，主要在非洲流行[2]。中國(guó)以間日瘧與惡性瘧最為常見，三日瘧少見，卵形瘧和諾氏瘧極少發(fā)生。

瘧疾的臨床診斷方法主要有：病原學(xué)診斷（如薄厚膜染色鏡檢、熒光染色鏡檢）[3]，病原學(xué)診斷作為瘧疾診斷的金標(biāo)準(zhǔn)；分子生物學(xué)診斷，主要擴(kuò)增瘧原蟲特異性片段RNA，其靈敏度高；免疫學(xué)診斷，主要檢測(cè)瘧原蟲特異性抗原，該方法操作簡(jiǎn)單、快捷，不需特殊儀器設(shè)備，適合基層醫(yī)院早期診斷，對(duì)于瘧疾感染的早發(fā)現(xiàn)、早治療和及時(shí)防控具有重要意義[4]。

英科新創(chuàng)研制的惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）采用夾心法原理，檢測(cè)全血中惡性瘧原蟲（Pf）特異性的富組氨酸蛋白Ⅱ（Pf HRP-Ⅱ）和間日瘧原蟲（Pv）的特異性瘧原蟲乳酸脫氫酶（Pv LDH），加樣后15~20min即可觀察結(jié)果，可用于瘧疾疑似患者的輔助診斷或瘧區(qū)病例的篩選檢查。

1 研究目的

對(duì)英科新創(chuàng)（廈門）科技股份有限公司的惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）進(jìn)行臨床評(píng)估，主要考察該產(chǎn)品與已批準(zhǔn)上市對(duì)照試劑之間的差異，評(píng)價(jià)該試劑的應(yīng)用意義。

2 試驗(yàn)管理

2.1 試驗(yàn)監(jiān)查

由申辦者的監(jiān)查員，定期檢查試驗(yàn)進(jìn)展、試驗(yàn)記錄與報(bào)告的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、完整無(wú)誤，保證試驗(yàn)遵循擬定的臨床試驗(yàn)方案實(shí)施。

2.2 試驗(yàn)人員培訓(xùn)

試驗(yàn)前各試驗(yàn)單位對(duì)所屬參加人員實(shí)施培訓(xùn)，要求熟知方案內(nèi)容，明確方案要求，熟悉檢測(cè)試劑的使用方法，知道如何處理試驗(yàn)中出現(xiàn)的常見問(wèn)題。

2.3 試驗(yàn)過(guò)程中的質(zhì)量控制

嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作；試驗(yàn)結(jié)果2人復(fù)核；對(duì)結(jié)果出現(xiàn)不同的標(biāo)本留存、登記，并根據(jù)方案要求進(jìn)行復(fù)檢；試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入后雙人核對(duì)確保無(wú)誤。統(tǒng)計(jì)方法正確。

3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 試驗(yàn)用試劑

3.1.1 考核試劑

名稱：名稱：惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）。

生產(chǎn)廠家：英科新創(chuàng)（廈門）科技股份有限公司。

3.1.2 對(duì)照試劑

名稱：惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲抗原檢測(cè)試劑（膠體金法）。

生產(chǎn)廠家：南通市伊士生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

注冊(cè)證號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3400109號(hào)。

3.1.3 第三方方法

薄厚膜染色鏡檢。

3.2 考核用樣本

試驗(yàn)共考核1 100例全血樣本，并對(duì)其中50例樣本分別采集了靜脈全血與指尖血，含有惡性瘧原蟲抗原或間日瘧原蟲抗原陽(yáng)性樣本數(shù)量均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為在臨床單位試驗(yàn)期間收集，置于2~8℃保存，7d之內(nèi)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，或之前收集的冷凍樣本，不低于-20℃保存。

3.3 檢測(cè)與分析方法

所有檢測(cè)試劑的使用，均嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書要求操作。

對(duì)臨床試驗(yàn)所有標(biāo)本，平行使用英科新創(chuàng)（廈門）科技股份有限公司的考核試劑與對(duì)照試劑進(jìn)行檢測(cè)。考核試劑與對(duì)照試劑檢測(cè)不符的樣本，可進(jìn)行復(fù)試，復(fù)試后仍不一致的樣本則采用第三方試劑進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)考核試劑與對(duì)照試劑的陽(yáng)性和陰性符合率，比較考核試劑與國(guó)家已批準(zhǔn)上市的同品種之間的差異，如表1所示。

表1 惡性瘧原蟲抗原靜脈全血試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

4 臨床研究結(jié)果綜合分析與評(píng)價(jià)

4.1 臨床結(jié)果綜合分析（靜脈全血樣本1100例）

4.1.1 惡性瘧原蟲抗原項(xiàng)

惡性瘧原蟲抗原靜脈全血的臨床試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1所示，綜合分析如下。

（1）陽(yáng)性符合率：322/322=100%

（2）陰性符合率：768/778=98.71%

（4）Pa=（322+768）/1 100=0.9909

（5）Pe=｛（322+0）（322+10）+（768+0）（768+ 10）｝/1 1002=0.5821

（6）Kappa=（Pa-Pe）/（1-Pe）=（0.9909- 0.582 1）/（1-0.582 1）=0.98＞0.75，兩者檢測(cè)結(jié)果有高度一致性。

5.1.2 間日瘧原蟲抗原項(xiàng)

間日瘧原蟲抗原靜脈全血的臨床試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2所示，綜合分析如下。

表2 間日瘧原蟲抗原靜脈全血試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

（1）陽(yáng)性符合率：180/180=100%（2）陰性符合率：885/920=96.20%

（3）樣本總符合率：（180+885）/1 100=96.82%（4）Pa=（180+885）/1 100=0.9682

因此，選擇適合香菇優(yōu)良品種，綜合考慮品種特性、市場(chǎng)需求和當(dāng)?shù)貧夂蛱攸c(diǎn)[7]，結(jié)合區(qū)域氣候、地形、人力等基本情況，加強(qiáng)并提高技術(shù)管理形成規(guī)范化的模式和技術(shù)規(guī)程，對(duì)于引進(jìn)菌類品種的栽培成功非常重要。跟進(jìn)當(dāng)?shù)貧夂蜃兓闆r，因地制宜及時(shí)進(jìn)行技術(shù)、管理調(diào)整，多參考前人成功事例，總結(jié)失敗與成功的經(jīng)驗(yàn)，是產(chǎn)業(yè)落地穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展的重要步驟。

（5）Pe=｛（180+0）（180+35）+（885+0）（885+ 35）｝/1 1002=0.7049

（6）Kappa=（Pa-Pe）/（1-Pe）=（0.9682- 0.7049）/（1-0.7049）=0.89＞0.75，兩者檢測(cè)結(jié)果有高度一致性。

4.1.3 考核與對(duì)照不符樣本的第三方試劑確認(rèn)結(jié)果

臨床考核試劑與對(duì)照試劑對(duì)靜脈全血樣本檢測(cè)結(jié)果共有45例不相符樣本。其中，有10樣本為考核試劑檢測(cè)結(jié)果為惡性瘧原蟲抗原陽(yáng)性、對(duì)照試劑檢測(cè)結(jié)果為陰性，經(jīng)第三方鏡檢確認(rèn)結(jié)果與考核試劑結(jié)果一致，均為惡性瘧原蟲抗原陽(yáng)性樣本；另外35例樣本考核試劑檢測(cè)結(jié)果為間日瘧原蟲抗原陽(yáng)性、對(duì)照試劑檢測(cè)結(jié)果為陰性，經(jīng)第三方鏡檢確認(rèn)結(jié)果與考核試劑結(jié)果一致，均為間日瘧原蟲抗原陽(yáng)性樣本。

4.2 靜脈全血與指尖血比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)（50例）

4.2.1 惡性瘧原蟲抗原項(xiàng)

惡性瘧原蟲抗原靜脈全血與指尖血的比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3所示。

表3 惡性瘧原蟲抗原靜脈全血與指尖血比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

4.2.2 間日瘧原蟲抗原項(xiàng)

間日瘧原蟲抗原靜脈全血與指尖血的比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表4所示。

表4 間日瘧原蟲抗原靜脈全血與指尖血比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

結(jié)果表明：考核試劑對(duì)惡性瘧原蟲抗原或間日瘧原蟲抗原在靜脈全血與指尖血兩種樣本類型檢測(cè)結(jié)果均一致，不存在差異。

5.3 相關(guān)疾病干擾情況統(tǒng)計(jì)

本次臨床試驗(yàn)中有艾滋病（80例）、乙肝（25例）、結(jié)核（20例）、肺炎（19例）、登革熱（7例）、新型隱球菌腦膜炎（4例）、恙蟲病（1例）、破傷風(fēng)（1例）和卵形瘧（1例）等引起相似癥狀疾病的標(biāo)本對(duì)考核試劑檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生干擾作用，間日瘧原蟲抗原與惡性瘧原蟲抗原的檢測(cè)不產(chǎn)生相互干擾作用。

6 討論與結(jié)論

本次試驗(yàn)共考察臨床樣本1 100例，其中，考核試劑共檢出惡性瘧原蟲抗原陽(yáng)性樣本322例，間日瘧原蟲抗原陽(yáng)性樣本180例；與對(duì)照試劑檢測(cè)結(jié)果作對(duì)比，考核試劑對(duì)惡性瘧原蟲抗原檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為98.71%，總體符合率為99.09%，kappa值為0.98；對(duì)間日瘧原蟲抗原檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為96.2%，總體樣本符合率為96.82%，kappa值為0.89。考核試劑對(duì)50例靜脈全血與指尖血樣本比對(duì)試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果完全一致。

試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)45例不符合樣本，即考核試劑檢出10例惡性瘧、35例間日瘧陽(yáng)性而對(duì)照試劑均顯示陰性結(jié)果，經(jīng)鏡檢確認(rèn)，考核試劑檢出陽(yáng)性是正確的。經(jīng)分析，其原因應(yīng)為考核試劑比對(duì)照試劑的樣本裂解液對(duì)新鮮樣本紅細(xì)胞的裂解更充分，從而確保待測(cè)抗原的釋放。試驗(yàn)中引起相似癥狀疾病的標(biāo)本對(duì)考核試劑檢測(cè)結(jié)果不產(chǎn)生干擾作用，間日瘧原蟲抗原與惡性瘧原蟲抗原的檢測(cè)不產(chǎn)生相互干擾作用。

由英科新創(chuàng)（廈門）科技股份有限公司研制的惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）試劑背景干凈，條帶清晰，結(jié)果顯示快速、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適用于人體靜脈全血或指尖血樣本中惡性瘧原蟲抗原或間日瘧原蟲抗原的檢測(cè)。