磷霉素對萬古霉素致腎損傷模型大鼠Keap1-Nrf2/ARE通路的影響*

黃曉青，黃麗蓓，楊斌，林子杰，梁雪，何慶林，丘岳

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530021)

萬古霉素是治療耐藥革蘭陽性菌，特別是金黃色葡萄球菌感染的一線藥物。萬古霉素主要經(jīng)腎消除，給藥劑量90%在給藥24 h內(nèi)從尿排出。萬古霉素腎損傷(vancomycin-induced kidney injury，VIKI)是限制其臨床應(yīng)用的原因之一，萬古霉素的腎毒性在給藥后4～8 d即可出現(xiàn)，表現(xiàn)為血清肌酐水平升高、腎小球濾過率降低等，其機(jī)制尚未完全清楚[1]。磷霉素作用于細(xì)菌細(xì)胞壁合成的早期，可破壞細(xì)菌外層結(jié)構(gòu)或改變聯(lián)用藥物進(jìn)入菌體途徑，使藥物在菌體內(nèi)易于富集而出現(xiàn)良好的協(xié)同作用，可與多種抗菌藥物聯(lián)合使用[2]。萬古霉素聯(lián)合磷霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及其引起的慢性生物被膜感染有協(xié)同殺菌作用。磷霉素聯(lián)合萬古霉素為臨床治療MRSA感染特別是萬古霉素血藥濃度較低部位如顱內(nèi)感染以及感染性心內(nèi)膜炎等常用聯(lián)合方案之一[3-4]。研究報道，磷霉素對萬古霉素、氨基糖苷類、順鉑等藥物引起的腎功能損傷有保護(hù)作用，機(jī)制尚未明確[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，磷霉素能有效改善萬古霉素所致大鼠腎損傷，其機(jī)制可能與抑制大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[5]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch like epichlorohydrin related protein-1，Keap1)-核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor E2 related factor，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element，ARE)(Keap1-Nrf2/ARE) 信號通路是機(jī)體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[6]，故本研究從Keap1-Nrf2/ARE氧化應(yīng)激信號通路及下游靶蛋白谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1，GPX-1)探討VIKI及磷霉素保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 注射用鹽酸萬古霉素(浙江醫(yī)藥新昌制藥廠，批號：1161191108)；注射用磷霉素鈉(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥廠，批號：H2018-3433)；總蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20191022)；尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201912)；腎損傷因子1(kidney injury molecule 1，KIM-1)試劑盒(Elabscience，批號XQG7W9KIS)；RNA提取試劑盒(美國Axygen公司，批號03712KD6)；逆轉(zhuǎn)錄試劑(Takara公司，批號 RR028A-1)；熒光染料SYBR Green (Throme公司，批號 00751233)；Nrf2、Keap1、GPX-1及β-Action 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2實驗動物 成年健康清潔級雄性SD大鼠，60只，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(桂)2019-0035。大鼠飼養(yǎng)于溫度為(26±1)℃、相對濕度為85%、清潔級動物實驗室內(nèi)，自由飲水進(jìn)食，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.3儀器 ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，Bio-Rad CFX Touch)；臺式高速冷凍離心機(jī)(艾本德中國有限公司，5810R)；連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司，SpectraMaxPlus384)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司，CKX-41)。

1.4動物分組與給藥 雄性SD大鼠60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、磷霉素組、模型對照組(萬古霉素組)和聯(lián)合用藥小、中、大劑量組(記為聯(lián)合-L組、聯(lián)合-M組、聯(lián)合-H組 )，每組各10只。正常對照組大鼠給予等劑量 0.9%氯化鈉注射液，模型對照組大鼠給予萬古霉素0.2 g·kg-1，磷霉素組給予磷霉素0.25 g·kg-1，聯(lián)合-L組、聯(lián)合-M組、聯(lián)合-H 組分別給予磷霉素0.125，0.25，0.5 g·kg-1，30 min后給予萬古霉素0.2 g·kg-1，均腹腔注射，每天 1次，連續(xù)21 d。給藥劑量依據(jù)：萬古霉素腎功能正常成人劑量一般2～4 g·d-1，兒童為0.06 g·kg-1·d-1。根據(jù)課題組前期研究，萬古霉素0.2 g·kg-1可成功造模[5]。磷霉素成人用量為4～12 g·d-1，嚴(yán)重感染可增加至12 g·d-1，兒童劑量為0.1～0.3 g·kg·d-1，因此聯(lián)合給藥組磷霉素設(shè)置了3個濃度。

1.5尿液KIM-1、24 h尿蛋白、NAG含量測定 給藥最后一天收集大鼠24 h尿液，常溫下3 000 r·min-1(r=10.9 cm)離心尿液10 min，上清液置于-80 ℃冰箱保存，測定尿中KIM-1、24 h尿蛋白、尿NAG。其中，KIM-1、NAG均采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法測定；24 h尿蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測定；實驗操作按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6實時熒光定量PCR 檢測腎組織Nrf2、Keap1、GPX-1 mRNA 表達(dá) 根據(jù)試劑盒步驟，提取腎組織RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以β-Action作為內(nèi)參。β-Action的引物序列上游：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游5′-CCACAGGATTCCATACCCAA-3′。Nrf2的引物序列上游：5′-TGCCCCTGTGGTCAAAGTG-3′，下游5′-GGTTCGGTTACCGTCCTGC-3′。KEAP1的引物序列上游：5′-GAGATATGAGCCAGATCGAGACG-3′，下游5′-GGTGTAATCATCCGCCACTCAT-3′。GPX-1的引物序列上游：5′-GTCCACCGTGTATGCCTTCTC-3′，下游：5′-CAGCAGGGCTTCTATATCGGG-3′。用Relative Quanti-fication Study分析方法進(jìn)行分析，用2-△△Ct法對PCR結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行計算。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠尿液KIM-1、24 h尿蛋白、NAG測定結(jié)果 與正常對照組大鼠比較，模型對照組24 h尿蛋白、NAG、KIM-1水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，聯(lián)合-M、聯(lián)合-H組24 h尿蛋白、NAG、KIM-1含量下降明顯(P<0.01)，且與磷霉素呈劑量依賴性，見表1。

表1 6組大鼠尿液KIM-1、24 h尿蛋白、NAG測定結(jié)果

2.2各組大鼠腎組織Nrf2、Keap1、GPX-1 mRNA表達(dá)情況 與正常對照組大鼠比較，模型對照組腎臟組織Nrf2 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，GPX-1 mRNA表達(dá)下降，keap1幾乎無變化，提示模型對照組已經(jīng)在萬古霉素誘導(dǎo)下發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。聯(lián)合-L及聯(lián)合-M 組Nrf2、Keap1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，聯(lián)合給藥3個劑量組GPX-1 mRNA 表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，提示磷霉素能激活GPX-1 mRNA表達(dá)。見表2。

表2 6組大鼠Nrf2、Keap1和GPX-1 mRNA表達(dá)情況

3 討論

VIKI的產(chǎn)生機(jī)制尚不完全清楚，可能包括[7]①免疫反應(yīng)：VIKI是由包括酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在內(nèi)的間質(zhì)浸潤對萬古霉素的免疫應(yīng)答。②急性腎小管壞死：a.氧化應(yīng)激，近曲小管細(xì)胞的氧化應(yīng)激是引起急性腎小管壞死最常見的機(jī)制。萬古霉素通過增加耗氧及三磷酸腺苷(ATP)濃度來刺激氧化磷酸化，形成鐵絡(luò)合物產(chǎn)生自由基。自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致線粒體膜去極化，釋放細(xì)胞色素C，激活半胱天冬酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)是一種氧化應(yīng)激蛋白，可催化血紅素生成膽綠素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和鐵離子，在氧化性腎損傷中發(fā)揮重大的保護(hù)作用。HMOX1可降低組織對氧化應(yīng)激的敏感程度，Nrf2是其主要的上游調(diào)控基因之一。b.管型形成[9]，多種因素可導(dǎo)致萬古霉素在腎小管內(nèi)過飽和和沉淀，包括藥物濃度過高和低尿pH值。萬古霉素能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞耗氧量升高，介導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，生成大量活性氧，導(dǎo)致氧化還原平衡失調(diào)，造成腎小管損傷[6，10-11]。

實驗選用雄性 SD 大鼠，原因在于雌鼠的雌激素含量相對較高，而雌激素具有顯著的抗炎作用，可能會影響實驗結(jié)果[12]。尿NAG是一種溶酶體水解酶，在腎小管上皮細(xì)胞中的含量相對較高，其含量水平能迅速反映腎小管實質(zhì)細(xì)胞的損傷情況，也可反映腎功能早期損傷情況。KIM-1是一種跨膜糖蛋白，主要由腎近曲小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，正常情況下表達(dá)較少或基本不表達(dá)(健康人群尿液中檢測不到)，當(dāng)缺氧或損傷時可刺激近端腎小管大量表達(dá)，尿KIM-1明顯增加[13-14]。血清尿素氮、肌酐為腎損傷的傳統(tǒng)指標(biāo)，而尿 KIM-1及NAG的靈敏度、特異性高，可作為一種快速反映早期腎損傷的生物標(biāo)志物[15]。與正常對照組大鼠比較，模型對照組尿液24 h尿蛋白、NAG、KIM-1含量顯著升高，聯(lián)合-M、聯(lián)合-H組24 h尿蛋白、NAG、 KIM-1含量下降。從聯(lián)合-M、聯(lián)合-H組的總體趨勢看，磷霉素對萬古霉素腎損傷的保護(hù)作用表現(xiàn)出劑量依賴性。

Keap1-Nrf2/ARE是近年來新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體抵抗外界氧化刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[16]。Nrf2是一種重要內(nèi)源性保護(hù)因子，可控制外周淋巴系統(tǒng)，維護(hù)及穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，間接發(fā)揮抗氧化作用，調(diào)節(jié)有關(guān)促炎癥反應(yīng)的刺激因素，保護(hù)相關(guān)細(xì)胞與組織，并且在病理性炎癥反應(yīng)中起到保護(hù)作用。通常情況下，Nrf2 在細(xì)胞質(zhì)中并不單獨存在，而是與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 Keap1 以二聚體形式結(jié)合存在。外界氧化應(yīng)激因子刺激后，Nrf2與Keap1解離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，通過 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路調(diào)節(jié)抗氧化酶基因，并誘導(dǎo)下游靶蛋白 GPX-1表達(dá)，激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)，啟動抗氧化作用，從而保護(hù)組織和細(xì)胞[17-18]。故本研究以Keap1-Nrf2/ARE信號通路為主，探討Nrf2、Keap1及下游蛋白 GPX-1 mRNA表達(dá)情況。

與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎臟組織Nrf2 mRNA表達(dá)升高，Keap1幾乎無變化，GPX-1 mRNA表達(dá)下降，提示模型對照組在萬古霉素誘導(dǎo)下發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，但并未激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路。采用磷霉素干預(yù)后聯(lián)合用藥組Nrf2、Keap1及GPX-1 mRNA表達(dá)均顯著升高，明顯高于正常對照組及模型對照組，提示磷霉素通過促進(jìn) Nrf2與 Keap1 解離，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合ARE，誘導(dǎo)下游靶蛋白 GPX-1 表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化反應(yīng)能力。

綜上所述，磷霉素通過刺激GPX-1 mRNA的表達(dá)改善萬古霉素引起的腎損傷，其機(jī)制可能是激活機(jī)體抵抗外界氧化刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)Keap1-Nrf2/ARE信號通路。

本研究不足之處是技術(shù)手段較單一，研究內(nèi)容不夠豐富，擬在下一步研究中采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗加以驗證，并進(jìn)一步研究VIKI的產(chǎn)生機(jī)制及磷霉素的保護(hù)作用。