不同毛色巴什拜羊皮膚組織中LEF1、YWHAZ及WNT2基因差異表達

洪文娟，侯晨曦，何宗龍，決肯·阿尼瓦什

(新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】在哺乳動物生長過程中，被毛作為毛囊發育的皮膚衍生物，生長和穩固被毛是毛囊最主要的生理功能。毛囊中的毛囊干細胞不僅能夠通過自分泌因子成纖維細胞生長因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18)實現自我調節，還可以調節其周圍黑色素細胞參與被毛顏色的形成過程，可以決定被毛的顏色[1]?！厩叭搜芯窟M展】Wnt信號因Wnt配體結合膜受體的不同而將Wnt信號分為三類[2]，其中最為經典的一類是Wnt/β-catenin信號通路[3]。被Wnt信號通路激活轉錄的靶基因是細胞特異性的。Wnt通路本身的調節也是多層次的，例如β-連環蛋白(β-catenin)、Frizzled(FZD)家族蛋白、肺耐藥蛋白(lung resistance protein，LRP)、淋巴增強因子-1(lymphatic enhancement factor，LEF1)/T細胞因子-3(T cell factor 3，TCF3)正向的調控因子，也存在如Dickkopf(DKK)家族基因等反向的調控因子[4]。真皮中的Wnt信號在表皮基板的形成過程中是必不可少的。抑制基因Dkk1的異位表達在Wnt/β-catenin信號通路中會導致真皮中β-catenin以及LEF1基因表達出現缺失從造成表皮基板的正常形成受到阻礙[5]。無義突變的小鼠在胚胎時期會出現皮膚中缺少LEF1陽性表達的表皮基板，具有功能的Wnt蛋白的產生和分泌在基板的形成過程中是必不可少的[6]。LEF1基因敲除后小鼠的觸須毛囊全部消失，被皮毛囊停止生長；當LEF1基因過表達時也會影響到觸須和毛發的正常生長[7,8]。Wnt/β-catenin信號通路能直接調控黑色素細胞特異表達基因如小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MIFT)等轉錄過程。MIFT同LEF1直接作用，協同上調多巴色素異構酶(dopachrome tautomerase，DCT)的表達?！颈狙芯壳腥朦c】小鼠的LEF1基因被敲除之后雖然不產生黑素但是黑素細胞依然存在，LEF1基因涉及黑素細胞合成或者向鄰近毛發角蛋白細胞轉運色素的能力[9]。Wnt/β-actenin信號在毛母質細胞生長期具有調控其增殖和分化的作用，毛母質細胞內的LEF1基因表達及核內聚集的β-catenin,毛母質細胞內擁有活躍的Wnt/β-actenin信號。當毛囊角蛋白細胞分化形成毛干，其基因表達過程中研究發現存在啟動子區域含有多個Tcf/LEF結合位點。上述角蛋白基因被認為是Wnt信號的靶基因[10]。WNT2基因是WNT家族的成員之一，在WNT2基因與腫瘤的形成和轉移之間的分子機制研究有較多的成果[11，12]，在細胞的生長、增殖過程中WNT2基因發揮著重要的作用，揭示了在此過程中WNT信號作用的細胞類型，在毛囊形成的不同階段WNT信號處在一個高度調節動態。WNT2基因具有潛在的研究價值，作為綿羊毛囊發育的潛在關鍵基因[13]。毛囊干細胞不僅實現自我調節，會調控其周圍的黑色素細胞參與被毛顏色的形成[14]。酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白ζ(tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein zeta，YWHAZ)基因是14-3-3家族成員之一，YWHAZ表達的蛋白是一種中樞蛋白，有結合功能多樣的信號蛋白的能力，包括跨膜受體、激酶和磷酸酶，在調節多種信號傳導途徑例如在Wnt/β-actenin信號通路、抑制細胞凋亡等發揮重要作用[15]。巴什拜羊皮膚中LEF1、WNT2、YWHAZ的表達情況與毛色之間相關性分析，尚未見到研究報道?！緮M解決的關鍵問題】研究LEF1、WNT2、YWHAZ作為潛在的毛色候選基因在mRNA表達水平上與毛色之間的相關性，為研究Wnt/β-actenin 信號通路在毛囊黑色素干細胞中的分子運行機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

試驗于2020年7月在新疆塔城地區裕民縣開展，從新疆謝利蓋畜牧有限公司隨機挑選被毛為黑色和白色周歲健康的巴什拜羊各8只，每種毛色公和母各4只。在其肩胛部將被毛剃干凈后用取皮器取皮膚組織2塊，裝入事先準備好的凍存管中，大小為1 cm2。迅速置于液氮罐中帶回實驗室用于總RNA的提取。

1.1.2 試劑和儀器1.1.2.1 試劑

Trizol Reagent、瓊脂糖、無水乙醇、氯仿、異丙醇、超純水、GoldView、PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，北京)RNase-free ddH2O、5×TBE緩沖液(Solarbio，北京)、D2000 DNA Maker(天根生化科技有限公司，北京)反轉錄試劑盒(RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit,天根生化科技有限公司，北京)、熒光定量試劑盒(Ribonuclease Inhibitor、SYBER Premix ExTaqTM天根生化科技有限公司，北京)。

1.1.2.2 儀 器

研缽；移液槍(Thermo)；超低溫電冰箱購自海爾家電公司；高速冷凍離心機購自Eppendorf公司；超凈工作臺購自上海博訊實業有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫療器械廠；DYY-6C型電泳儀及瓊脂糖水平電泳槽均購自北京市六一儀器廠；Infinite M200型酶標儀購自上海研域儀器設備公司；Gel Doc 2000型凝膠成像儀購自Bio-Rad公司；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

按照Trizol法提取巴什拜羊皮膚組織的總RNA，-80℃保存備用。取4 μL總RNA用于RNA品質的檢測，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，220V，15 min。再用分光光度計測定總RNA濃度，選出D260nm/D280nm值在1.8～2.0 RNA樣品。最后按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA。

1.2.2 引物設計與合成

比較GenBank中其它哺乳動物LEF1基因cDNA編碼序列的同源性，借助Primer5.0plus軟件，設計出1對擴增產物為108 bp引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。同理設計出YWHAZ，WNT2基因的引物。

1.2.3 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的特異性

取適量的反轉錄產物為模板，以特異性的引物進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL：cDNA模板1 μL，2×TaqPCR Mix11μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase-free aaH2O 7 μL。PCR反應循環數的設置：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸10s，37個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測。PCR產物純化后送生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.4 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因定量

qRT-PCR反應體系20 μL：cDNA模板2 μL，2×SYBR Premix ExTaq10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase-free aaH2O 7 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變形30s，60℃退火30s，37個循環；95℃變性10s，65 ℃退火30s(65～95℃升溫為0.50℃/s)。用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀完成。

1.3 數據處理

PCR和qRT-PCR反應結束后，以溶解曲線來判定qPR-PCR反應的特異性，根據CT值來計算定量結果。內參基因β-actin與目的基因LEF1，YWHAZ，WNT2，在同一條件下不同PCR管中進行擴增，每個樣本設3個重復。

qRT-PCR數據用Microsoft Excel 統計分析，結果均用“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。2-△△CT法計算LEF1，YWHAZ，WNT2在黑色與白色巴什拜羊皮膚中基因的相對表達量，△CT目的基因=CT目的基因-CT內參基因，△△CT=△CT白色組-△CT黑色組，目的基因在不同毛色綿羊皮膚中mRNA差異表達倍數以2-△△CT表示。采用單因素方差分析和顯著性檢驗的方法，利用SPSS21.0軟件對數據進行分析，運用GraphPad Prism 8 軟件繪制柱形圖。P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。利用轉錄組測序結果相互驗證qRT-PCR結果，轉錄組織數據來源于對課題組前期研究，轉錄組的部分數據通過采用 (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped，FPKM)片段法來計算轉錄水平。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取及鑒定

研究表明，部分試驗樣品可以明顯看到28S，18S，2條帶亮度好，清晰度高，5S條帶不明顯，說明試驗提取的總RNA完整性好。用核酸蛋白測定儀，RNA樣品的OD260nm與OD280nm比較均值為1.8～2.0。RNA符合試驗要求。圖1

圖1 總RNA質量檢測

2.2 引物設計與合成

引物信息見表1。

2.3 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的特異性

研究表明，三條目的條帶大小分別為108 bp，166 bp，131 bp左右，且條帶清晰，無二聚體或非特異性條帶,于預期片段大小一致。LEF1、YWHAZ、WNT2可在綿羊體內正常表達。LEF1通過測序獲得的序列信息：CTCTATCCAGGCTGGTCTGCAAGAGACAATTATGGT-AAGAAAAAG AAGAGGAAGAGAGAGAAGCTACAGGAGTCCACA TCAGGTACAGGTCCAAGAATGACAGCTGCC。圖2

實時熒光定量目的基因和內參基因引物序列：基因LEF1、YWHAZ、WNT2、β-actin，引物序列(5′→3′)分別為5′-CTCTATCCAGGCTGGTCTGC-3′ 5′-GGCAGCTGTCATTCTTGGAC-3′、5′-AACGAGCTGGTACAGAAGGC-3′ 5′-AAGATGACCTACGGGCTCCT-3′、5′-AACGCCTGTCTCGTTGGAAT-3′ 5′-GGCACGTTGTCACACATCAC-3′、5′-CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′ 5′-GCCAGGGCAGTGTATCTCTTT-3′，退火溫度分別為55℃、58℃、57℃、57℃，GenBank序列號分別為NC_040257.1、NC_040260.1、NC_040255.1、NC_040275.1，PCR產物分別為108、166、131、97 bp。

WNT2通過測序獲得的序列信息：AACGCCTGTCTCGTTGGAATCTGGCTCTGGCT-CCCTCTAC TTTACCTGG-CTCAGCCCTGAGGTCAGCTCTTCA TGGTGGTACATGAGAGC-TACGAGTGGCTCCTCCAGGGTGATGTGTGACAACGTGCC。

YWHAZ通過測序獲得的序列信息：AACGAGCTGGTACAGAAGGCCAAACTGGCCG-AGC AGGCTGAGCGATATGATGACATGGCAGCCTGCAT GAAGTCTGTAACTGAGCAA-GGAGCTGAATTA TCAGGAATCTTCTCTCAGTTGCTTATAAAAATGTT GTAGGAGCCC-GTAGGTCATCTT。圖2

注:M:DL2000 DNA Marker;1～3:β-actin基因；4～8:YWHAZ基因；9～11:WNT2基因；12～14:LEF1基因

2.4 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的mRNA表達量

研究表明，綿羊皮膚組織中LEF1、YWHAZ、WNT2基因和β-actin基因qRT-PCR擴增曲線拐點清楚，平行性良好，符合“S”型標準；溶解曲線有且只有一個峰，并且Tm值都在80～90 ℃，qRT-PCR反應中收集的信號都來自引物的特異性擴增。圖3

2.5 LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR

研究表明，LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中均能表達。并且在皮膚中表達差異極顯著(P<0.01)，黑色的表達量明顯高于白色的表達量。表1

圖3 3個目的基因與內參基因的溶解曲線圖及擴增曲線

表1 LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR結果

WNT2基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中均能表達。并且在皮膚中表達差異極顯著(P<0.01)，在黑色被毛的巴什拜羊皮膚中的表達量明顯高于白色被毛的巴什拜羊的表達量。表2

YWHAZ基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中均能表達。并且在皮膚中表達差異極顯著(P<0.01)。在黑色被毛的巴什拜羊皮膚中的表達量明顯高于白色被毛的巴什拜羊的表達量。表3

表2 WNT2基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR結果

表3 YWHAZ基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR結果

2.5 LEF1、WNT2、YWHAZ基因的轉錄組信息和熒光定量對比

研究表明，LEF1基因mRNA在黑色綿羊皮膚中表達量是白色綿羊皮膚的10倍，WNT2基因mRNA在黑色綿羊皮膚中的表達量是白色綿羊皮膚的20倍，YWHAZ基因mRNA在黑色綿羊皮膚中表達量是白色綿羊皮膚的11倍。圖5

LEF1、WNT2、YWHAZ基因在黑色巴什拜羊皮膚中的表達量均高于白色巴什拜羊皮膚中表達量。圖6

注：**肩標表示差異極顯著(P<0.01)

圖6 轉錄組中LEF1、WNT2、YWHAZ基因的FPKM值

3 討 論

哺乳動物的毛囊(Hair Follicle，HF)存在幾類干細胞群，作為功能性的器官，HF的再生依賴于不同干細胞相互之間及時且有組織的協調作用。HF的突起和次級毛基質細胞中不僅有上皮干細胞(epithelial stem cells，EpSCs)，還有與毛發顏色相關的黑色素干細胞(melanocyte stem cells，McSCs)。在HF生長的早期(agagen，生長期)，分化的McSCs通過將自身產生的黑色素轉移給鄰近的上皮細胞，在HF生長的晚期(telogen，休止期)，分化的色素細胞會隨著小部分的HF的退化而凋亡[16]。研究表明，Wnt/β-actenin是調節McSCs分化和色素沉著的重要信號通路。McSCs自身不能產生Wnt的配體，但是研究發現表達角蛋白(keratin，Ks)的上皮細胞可以產生能夠激活Wnt信號的配體。通過芯片分析技術和qRT-PCR找到了Wnt的直接作用位點是內皮素1(Endothelin1，EDN1)，在Wnt激活的上皮細胞中，伴隨著EDN1的表達量的升高，表現為McSCs的增殖的升高。Wnt信號是偶聯McSCs與EpSCs的關鍵信號通路，這兩種干細胞群在毛囊生長期協同激活Wnt信號，黑色素干細胞中Wnt信號的激活促使其分化為產生黑色素的細胞，而上皮干細胞中Wnt信號不僅促使毛囊的形成而且在毛發再生過程中調節黑色素干細胞的增殖[6]。有研究表明局部應用十四烷酰佛波醇-乙酯(TPA)可以激活Wnt/β-actenin信號，刺激黑色素干細胞的增殖和分化，促進頭發基質色素的沉著[17]。WNT2基因在毛囊的形態形成方面有重要作用，主要體現在調節毛發長度[6]。試驗研究發現WNT2基因在黑色和白色被毛的綿羊皮膚中均有表達，且在黑色被毛皮膚中表達極顯著高于白色(P<0.01)，WNT2在Wnt/β-actenin信號通路中作用的分子機制有待進一步研究。

LEF1和TCF3分別作為TCF和LEF家族中在毛囊發育方面發揮著重要作用的轉錄因子，LEF1主要在毛乳頭(dermal papilla，DP)細胞、內根鞘(inner root sheath，IRS)、外根鞘(outer root sheath，ORS)和毛母質細胞(hair follicle matrix cell)中表達，而這些細胞可以定向分化成間充質細胞和前皮質細胞形成毛發[18]。當LEF1過表達時，導致β-actenin信號通路阻斷，導致毛囊形態異常，促進毛囊干細胞分化成為皮脂腺和上皮細胞[19]。試驗研究發現LEF1基因在綿羊的黑色和白色被毛皮膚中均有表達，且在黑色被毛中的表達極顯著高于白色(P<0.01)。研究結果與楊磊等[20]在棕色和白色羊駝皮膚中LEF1基因差異表達趨勢一致。β-actenin可以作為MITF基因特異性的靶啟動子來激活轉錄[21]。MITF與LEF1的功能合作導致DCT基因啟動子的協同轉激活，DCT是一種早期黑色素細胞標記物，MITF/TFE3家族是一類新的LEF1核調節劑，保證Wnt信號在多種類型的細胞中有效傳播[22]。DCT是酪氨酸酶合成家族的成員之一，作為黑色素合成的關鍵酶基因，產生的蛋白在黑色素合成過程中起主要的促進作用[23]。韓吉龍等[24]研究表明MITF基因的mRNA表達量在黑色被毛的藏羊皮膚組織顯著高于棕黑色和白色被毛的藏羊。LEF1的變化趨勢與MIFT和DCT一致，符合LEF1先前研究的調控機制。這一結果表明，LEF1很有可能參與了綿羊毛色形成的過程。

皮膚黑色素瘤產生于皮膚黑色素細胞的惡性轉化，因腫瘤基因或者腫瘤抑制基因的突變積累到一定程度迫使黑色素細胞的異常增殖并擴散到身體的其它器官。黑色素瘤中細胞凋亡的“關閉”，導致其具有強大的生存能力[25]。代杰等[26]的研究結果顯示對YWHAZ基因進行敲除后，皮膚中的黑色素細胞瘤細胞增殖出現減慢、細胞凋亡加快、細胞的遷移及侵襲能力減弱，并且研究顯示黑色素瘤組織中YWHAZ的平均相對表達量明顯高于良性痣中YWHAZ的平均相對表達量(P<0.01)。Konstantakou等[27]對WM-266-4轉移性黑色素瘤的細胞株采用納米液相色譜-串聯質譜(nLC-MS/MS)蛋白質組學技術分析發現：YWHAZ對B型迅速加速性纖維肉瘤(B-type rapidly accelerated fibrosarcoma，BRAF)基因和MITF基因產生特異性相互作用，并且BRAF和MITF共同受YWHAZ的調控。BRAF作為皮膚黑色素瘤的靶點是最重要的小分子抑制劑。試驗研究發現YWHAZ基因在黑色和白色被毛的綿羊皮膚中均有表達，且在黑色被毛皮膚中表達量極顯著高于白色(P<0.01)，表達量為(4.15±0.230 0)是在正常范圍內。YWHAZ通過調控MITF影響黑色素細胞的增殖和分化，以及通過這種相互作用影響黑色素細胞瘤的發生的分子機制有待進一步研究。

4 結 論

LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色的巴什拜羊皮膚組織中均有表達。且LEF1、WNT2及YWHAZ基因在黑色綿羊皮膚中的表達量極顯著高于白色綿羊皮膚(P<0.01)，LEF1、WNT2及YWHAZ參與毛色的形成過程，可作為綿羊毛色潛在基因研究與毛色之間的相關性。黑色被毛的巴什拜羊LEF1、WNT2、YWHAZ基因的表達量極顯著高于白色被毛色的巴什拜羊(P<0.01)，LEF1、WNT2、YWHAZ基因與綿羊毛色的形成具有一定的相關性。

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